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《高羊茅高頻再生體系的建立和基因槍法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究3b高羊茅幾丁質(zhì)酶基因ⅰ保守片段的克隆及其序列分析》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、撼蓑高羊茅(Festucaarundinace葡，又稱葦狀羊茅，系采本科(Gramineae)羊茅屬植物，原產(chǎn)西歐、jb菲，窀其有抗旱、耐瘠薄，適斑性廣簿特點(diǎn)，在城市綠純及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪鋪設(shè)中瘟建十分廣泛。蜒出予窀連存在峙只糕糙、沒(méi)富鐲匐莖、爰拳生長(zhǎng)緩橙、荔遺瘸瓣體幫聚草侵害等照質(zhì)上的缺陷，因聰瓣要對(duì)其進(jìn)杼品種潑良。邂過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培蠢出其餐優(yōu)嶷抗逆性狀且夔觀的商羊茅晶系近年米備受人們的重視。植物j敷傳轉(zhuǎn)化的先決條件是高頻再生體系的建立，放本研究首先以高篳茅成熟種子為多}稽俸、以Ⅺs為基奉薅養(yǎng)基，研究了商羊茅箍性愈傷組緩誘導(dǎo)和繼代、磊生植株分純和生根等培葵
2、蒸中各級(jí)分豹簸逶配魄，建立了建叛再生體系。實(shí)驗(yàn)續(xù)聚表明在鼴援gm∥L2，4固的MS培養(yǎng)旗上愈傷組織誘導(dǎo)頻率最蕊，初擻愈傷組織在禽育5m∥L2，4-D、400mg／LCB、609／L蔗糖和129／L瓊脂的IlS繼代培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出胚性愈傷組織和體細(xì)胞脛。在禽2．Omg／L6一BA和0．5mg／LNAA的MS培養(yǎng)基上分化形成叢生苗，分化頹率達(dá)到78．9％。再生螢在1／2lIS+NAA0．輛g／U生禳培養(yǎng)基上生撤率達(dá)100％。蕊對(duì)發(fā)現(xiàn)在繼棧培養(yǎng)基串將蔗糖和璩鼴濃度撮癱、{!圭及添如一定爨豹cll從露形成一個(gè)舞滲環(huán)境能明顯撼囊題性愈傷緞織的矮量和誘導(dǎo)頻率，十
3、分有剎于后期的分化，邀是高攀茅高頻再生體系形成的一個(gè)非常*鍵的因素。艇因槍技術(shù)蠅禾本科植物遺傳轉(zhuǎn)化的常用方法，本二c作利用PDSIOOO／He基因槍將質(zhì)粒pARN6(黨隆有水稻Jh]。質(zhì)酶基因gC24)鞠質(zhì)粒pD(克隆有0一葡糖醛酸耱苻酶基因占坩鞠選擇標(biāo)記基囂bar)導(dǎo)入高滲薤理觸左套豹離葦茅坯贛愈傷綴織，在分剝辯熱2。溉∥L、3。鋤∥L、5．OmgA除草裁PPT(摹l‘膦)魄分化壤葵基上黠轟戎楗辯進(jìn)抒撈度薅選翻培萋，結(jié)果在附加2．Omg／L的PFI'培養(yǎng)基上愈傷組織基本上全部生長(zhǎng)正常；在附加5。Omg／kPPT的培養(yǎng)基上。愈傷組織幾乎全部死亡{而在
4、附加3．Omg／LPPT的培養(yǎng)接上，大部分愈傷組織逐漸變?yōu)楦Ｉ劳觯俨糠帜苷Ｉ?。由此可?jiàn)．采用3mg／L的PPT篩選濃度較為臺(tái)遙。經(jīng)赭逡器生焉莢獲褥93揀秀生箍株，；{=
5、含有0．2％Tveen-20豹200m∥LPw溶液對(duì)楗株葉片進(jìn)行嚷灑，最終從93撼褥生擅檬中臻選出辮株時(shí)冀始終-泰糖荽麴再生蓮，經(jīng)PCR貉定初步確定為轉(zhuǎn)化植株。另外本，l：作揪據(jù)兒種采本科植物j類JkJ‘質(zhì)酶氨基隧序列及其基因核箭酸序列的同I灝性比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)出一對(duì)簡(jiǎn)并引物(P1：5’-TGCCCCAACTGCCTCTGCT一3’、P2：5’-ccT餓G(T／C)TGTAGC
6、AGTC(c／G)A一3’)，通過(guò)PCR艇廊克隆了兩條高羊茅幾丁質(zhì)酶基因片段?！?用0．2％氯化汞溶液處理幼嫩葉片24h，提取總RNA，同時(shí)從新鮮幼嫩葉片中提取總DNA，鼓二囊為摸教分別進(jìn)行RT-PCR幫PCR反應(yīng)，擴(kuò)壤囂褥§《囂令長(zhǎng)度各為849bp秘843bp的DNA贊段，分捌命名為fescue-1及fescue-2：縫六穰秘譯后推導(dǎo)出兩個(gè)遘續(xù)完整的氨基酸序列。分別命名為gym-pro-1及gym—pro-2。懶j懶弛i酊軟f憷行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)推導(dǎo)出的氮基酸序列相似性達(dá)到99％，兩個(gè)核苷酸序列相似性達(dá)到97％。譙NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST搜索，
7、結(jié)果表明它們的核螢酸序列和氨蒸教序列分別和其它j艮本葦；}植物的I類幾丁豢薅萋因彥魏蠢蠹薹黧黲期鴦?shì)^蹇鶼露漂瞧，其中，gym—pro一1與翠熱蓉、丈麥及黑麥l類幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列相似性分別商達(dá)85％、87％和8496。同源性比對(duì)結(jié)果顯豕，兩條擴(kuò)增片段在序列上具有微小差異，遮表明fescue一1與fescue-2并非來(lái)自予同一個(gè)基因，即RT-PCR中擴(kuò)增產(chǎn)生rescue一2的mRNA勢(shì)不是PCR中擴(kuò)罐產(chǎn)熏fescue一1麴攘裁撼A熬轉(zhuǎn)錄產(chǎn)凌。本王攆察簸臻萊顯示在襄蘋蒡中霹藐存在一個(gè){類』L丁質(zhì)酶多基因家族，謹(jǐn)們?cè)诤藸I(yíng)酸序列和氯濺酸序列上具有高度的同源
8、性。關(guān)鍵詞：高羊茅；高頻再嫩體系：微彈轟擊{I類幾]。質(zhì)酶；同=i瑪i性。羲AbstractFesmcaarundinacea，whichbelongstothefamilyGramineae，originatedinWestEuropeandNorthAfrica。Notonlydoesitpossessthecharacteristics程dmught-resistance,barrenness-toleranceandhi蚺adaptability,butalsoitcallbeusedtobeautifyurbanenvironmentand
9、coverplaygrounds．However,sinceitalsohasdisadvantagessu
