檉柳抗逆分子機理的研究和相關基因的克隆

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1、摘要檉柳是抗逆能力強的植物，可以在于早和鹽漬化土壤上良好生長。以檉柳為主要研究材料，應用差異顯示、消減雜交、EST分析、基因芯片等技術研究其抗逆分子機理-并對部分抗逆基因進行克隆。建立了兩種木本植物總RNA的提取方法。兩種方法均以硼砂為緩沖液，分別用SDS、和CTAB為主要提取試劑，可以提取出高質(zhì)量的木本植物總RNA；SDS方法同時可以用于真菌、昆蟲等的RNA提取。對LiCl沉淀方法進行了重要改進，改進的方法可在10min內(nèi)完全沉淀RNA。用差異顯示技術研究了NaHC03脅迫下檉柳的基因表達情況，經(jīng)Northern檢測共獲得了17個基因片段，BlastX分

2、析表明，有2個基因與F-box類蛋白家族成員同源性較高。1。個基因與翻譯起始因子elF成員有高的同源性。還獲得了分別與分泌型過氧化物酶和過氧化物酶基因同源性高的基因片段，過氧化物酶為植物對抗逆境脅迫的常見基因。另外，有5個與鹽堿脅迫密切相關的新序列，它們在脅迫前后差異表達明顯。這17個序列的GenBank接受號為CD028574．CD028581和CD028583一CD028591。應用消減雜交技術研究了NaHC03脅迫下檉柳的基因表達情況，以NaHC03脅迫檉柳eDNA為試驗方(tester)，正常生長檉柳cDNA為驅(qū)動方(Driver)。經(jīng)Northe

3、rn雜交檢測，共獲得36個鹽脅迫應答基因。BlastX分析表明，它們與下列基因同源：CAT和PRDX2個抗氧化酶基因：編碼海藻糖磷酸酯酶的基因；多種調(diào)控基因，包括bZIP轉(zhuǎn)錄因子、MADS—box蛋白，富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白(Glycine—richRNA．bindingproteins)、CCCH型鋅指蛋白、F-box蛋白等的調(diào)控基因；早期光誘導蛋白，該基因可以修復由脅迫引起的植物光合系統(tǒng)損傷；半胱氨酸蛋白酶和VPE酶(vacuolarprocessingenzyme)，它們起降解受損細胞作用；以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白前體、聚合泛素、查爾酮合酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶

4、、NADP一／DH、OEEl等；同時，發(fā)現(xiàn)了6個鹽脅迫應答的新基因。用差異顯示技術研究了NaHC03脅迫下星星草的基因表達情況，經(jīng)反向Nortbem檢測，獲得了7個差異表達基因片段。其中，6個為脅迫后誘導表達的基因，1個為脅迫后抑制表達的基因。序列同源性分析表明，誘導表達的6個基因中，1個與鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)同源性較高，其余5個為新序列，脅迫后抑制表達的基因與假定adaptor蛋白同源性較高。結(jié)果提示，在NaHC03脅迫后，星星草可能通過CDPK正向調(diào)控其抗鹽能力，并調(diào)控脅迫信號的轉(zhuǎn)換。獲得的7個基因片段已經(jīng)在GenBank登錄，登錄號為CFl9

5、8398--CFl98404。構(gòu)建了檉柳的cDNA文庫。以NaHC03脅迫的檉柳為材料建立了cDNA文庫，文庫的初始滴度為5．7x105p如，重組率為96％，插入片段平均長度約1．2kb，擴增后文庫的滴度為3．9x109pfu／mL。對檉柳進行了EST分析，共獲得2455條ESTs序列，它們代表了1936條無重復的單～序列(uniquesequence)a共有1452條ESTs與己知基因序列同源，其中：1452條ESTs與Nr數(shù)據(jù)庫蛋白同源，其余1386條為新序列。對EST進行了GO(Oene========：=!====：。===============

6、=======!=======；======；=一Ont0109y)分類，將這些ESTs分成了分子功能、生物學途徑和細胞組件三部分，同時進行了pathway分析，共發(fā)現(xiàn)了125個生物學途徑。已知ESTs按功能分為12類，其中代謝占18．53％、防御占18．80％、蛋白質(zhì)合成占6．75％、能量占4．61％、轉(zhuǎn)運占6．75％、蛋白質(zhì)定向占7．09％、信號轉(zhuǎn)導占5．17％、細胞生長、分裂占4．61％、轉(zhuǎn)錄占6．75％、光合占8．82％、細胞結(jié)構(gòu)占1．79％、功能未知占10．33％。共發(fā)現(xiàn)了近400個與抗逆相關的EST序列，分析顯示檉柳抗逆是個多途徑作用的復雜體系

7、，涉及脅迫信號轉(zhuǎn)導與基因的表達調(diào)控、活性氧清除、水分和離子的轉(zhuǎn)運、滲透調(diào)節(jié)、脫水保護等多種途徑。用基因芯片技術研究NaHC03及干旱脅迫下檉柳基因的表達。將Cy5一dCTP分別標記在干旱和NaHC03處理檉柳的eDNA上，Cy3一dCTP標記在對照檉柳eDNA上。通過探針與芯片雜交，通過對兩種雜交信號強度比值的分析研究基因的差異表達，獲得了檉柳的干旱脅迫的基因表達譜和NaHC03脅迫的基因表達譜。其中，NaHC03脅迫共獲得了89個差異表達的基因。其中，27個下調(diào)表達和62個上調(diào)表達的基因。BlastX分析表明這些基因按功能可以分為光合作用、活性氧清除、滲

8、透調(diào)節(jié)、信號傳導與表達調(diào)控、代謝、發(fā)育相關、核糖體蛋白、蛋白質(zhì)的分