東方巴貝斯蟲免疫相關(guān)蛋白基因克隆及功能的研究

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1、東方巴貝斯蟲免疫相關(guān)蛋白的基因克隆及功能研究摘要東方巴貝斯蟲(Babesiaorientalis)是一種由鐮形扇頭蜱傳播的重要血液原蟲，主要引起水牛巴貝斯蟲病。該病在我國長江以南許多省份發(fā)生和流行，臨床上患病牛以高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿等為特征，甚至引起死亡，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)室已完成了對B．orientalis的形態(tài)學(xué)、生活史、傳播媒介和分子分類學(xué)研究，從多種研究角度證實(shí)了該蟲為一新種，并構(gòu)建了B．orientaliseDNA文庫。本研究以該文庫為基礎(chǔ)，用制備的B．orientalis單抗和多抗對B．oriental&eDNA文庫進(jìn)行免疫篩選。對篩選得到陽性克隆子進(jìn)

2、行DNA序列的測定、拼接和分析，并進(jìn)一步克隆表達(dá)單抗所篩得的東方巴貝斯蟲蛋白BOP29，對BOP29蛋白進(jìn)行了west-blotting檢測和原位間接免疫熒光定位。利用表達(dá)的重組BOP29蛋白構(gòu)建間接ELISA診斷方法，并初步應(yīng)用于血清流行病學(xué)的調(diào)查。(1)B．orientalis單克隆抗體的制備從感染B．orientalis的染蟲血中提取東方巴貝斯蟲蟲體全蛋白。用粗提的東方巴貝斯蟲裂殖子全抗原免疫Balb／c小鼠，制備免疫脾細(xì)胞，通過常規(guī)的細(xì)胞融合技術(shù)與sp2／0骨髓瘤細(xì)胞融合，用東方巴貝斯蟲裂殖子抗原(BoMAg)、東方巴貝斯蟲體外培養(yǎng)上清(BoECSAg)作為捕獲抗原來篩選

3、陽性克隆，最后得到了11株高效價(jià)的單克隆雜交瘤細(xì)胞系，分別為ⅣC2A71Glo、IVc2A72E2、IVC2ATlF6、IVC2A72G4、IVC2A72C5、IVC2A72FIo、IVC2A71E3、[VC2A72F2、VC9C6A2、VC9C781和VC9C6C11。為eDNA文庫的免疫篩選奠定基礎(chǔ)。(2)t7．orienta凰eDNA文庫的篩選用自制的東方巴貝斯蟲單抗和多抗對該蟲的eDNA文庫進(jìn)行篩選。得到與單抗VC9C6Cll對應(yīng)的東方巴貝斯蟲BoP。29蛋白的基因序列和與多抗發(fā)生免疫反應(yīng)的8個(gè)東方巴貝斯蟲蛋白的基因序列：ms．7．1，ms．37．1，ms．59．1，ms

4、．70．2，ms．88．2，ms．99．1，ms．110．1和ms．128．1。經(jīng)過測序比對和蛋白預(yù)測，顯示單抗篩得的BOP29蛋白約為29kDa，DNAstar預(yù)測該蛋白的等電點(diǎn)為9．68，有很好的抗原性；多抗篩得8個(gè)蛋白中ms．7．1、ms．37一l、ms．59．1、ms．99．1和mS．110．1與牛巴貝斯蟲的某些已公布的蛋白有較高的同原性，ms．88．2克隆子與布氏錐蟲假定蛋白Tbl0．70．1650有34％的同原性，ms．70．2和mS．128．1在同源比對中沒有任何相關(guān)信息，可能是東方巴貝斯蟲特有的新蛋白，其結(jié)構(gòu)功能還待進(jìn)一步研究。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文(3)BoP

5、．29蛋白的克隆表達(dá)根據(jù)EST測序的結(jié)果，設(shè)計(jì)一對特異性擴(kuò)增B．orientalisBOP29基因開放性讀碼框(0I強(qiáng))的引物，克隆了B．orientalisBOP29的ORF全長基因，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX—KG—BOP29和pET-28(a)．BOP29，在E．coliBL21．CodonPlus中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。(4)BoP一29蛋白的定位與免疫原性的初步研究將重組BOP29的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western．blot檢測分析，結(jié)果表明原核表達(dá)的BOP29具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)原性。將染蟲率為1％的新鮮牛血制成血推片，固定后，用單抗VC9C6C1l做為一抗，羊抗鼠IgG．FICT抗體

6、做為二抗來完成間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，并再用吖啶橙染核。將制好的血液推片置于熒光顯微鏡下觀察，可見染蟲紅細(xì)胞中的蟲體核部發(fā)橙色熒光和與單抗結(jié)合發(fā)出綠色熒光的蟲體膜表面。再次證實(shí)BoP．29確實(shí)來源于東方巴貝斯蟲。(5)His-BoP一29間接ELISA診斷方法的構(gòu)建和應(yīng)用將重組的His-BoP29蛋白按倍比稀釋的方法包被ELISA板，測定其最佳包被濃度。用參考陽性血清和參考陰性血清確定His-BoP-29間接ELISA的臨界值為O．25，有良好的敏感性和特異性。用該間接ELISA方法完成了對感染牛血清中抗體水平的監(jiān)測，并檢測了來自武漢、湖北大冶、湖北嘉漁和湖北鞍山臨床血清樣本共132份

7、，共檢出陽性39份，總檢出率為29．5％，而用本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的東方巴貝斯蟲巢式PCR檢測結(jié)果(33．3％)無顯著差異。本研究以B．oriental&的eDNA文庫為基礎(chǔ)，利用制備的東方巴貝斯蟲的單抗和多抗血清篩選文庫，獲得9個(gè)巴貝斯蟲相關(guān)蛋白的基因序列，為水牛巴貝斯蟲病的免疫預(yù)防、致病機(jī)制等研究奠定良好的基礎(chǔ)。對單抗篩得的BOP29蛋白的基因完成了克隆表達(dá)定位，證實(shí)了BOP29蛋白確實(shí)存在于東方巴貝斯蟲中，且有良好的免疫反應(yīng)原性。隨后，利用重組BOP29蛋白構(gòu)建ELISA檢測方