lps刺激對單核細(xì)胞mirna表達(dá)譜的影響

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1、LPS刺激對單核細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響LPS刺激對單核細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響專業(yè)名稱：重癥醫(yī)學(xué)學(xué)位申請人：周仁祥導(dǎo)師：熊旭明教授中文摘要背景膿毒癥（sepsis）是由感染所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是機(jī)體對外源性致病微生物如細(xì)菌、真菌、病毒等進(jìn)行免疫應(yīng)答過程中所出現(xiàn)的失控的炎癥反應(yīng)并最終可能導(dǎo)致多器官功能障礙。膿毒癥發(fā)病率高，大多病情危重，加之治療技術(shù)手段有限，因而成為現(xiàn)代危重病醫(yī)學(xué)所面臨的一個重大挑戰(zhàn)。病原體入侵機(jī)體后可被機(jī)體的抗原提呈分子識別，繼而與炎癥細(xì)胞結(jié)合，啟動炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放。失衡的炎癥細(xì)胞活化及炎癥因子釋放，

2、通過影響血流動力學(xué)、凝血及細(xì)胞凋亡等機(jī)制進(jìn)一步損害各臟器的功能。目前膿毒癥尚缺乏特效分子靶向治療，以使用抗生素、強(qiáng)化液體管理及實(shí)施支持治療為主導(dǎo)的治療策略并未能顯著降低膿毒癥患者的病死率，盡管2002年巴塞羅那宣言上提出通過集束化管理等措施在5年內(nèi)減少25%膿毒癥患者病死率的遠(yuǎn)景目標(biāo)，但最終只減少了近6.2%的病死率。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA,由21~25個核苷酸組成，通過形成miRNA核蛋白體復(fù)合物（miRNPs）與靶標(biāo)mRNA的堿基完全或部分配對，從而產(chǎn)生抑制或降解作用，調(diào)控目的基因的表達(dá)。研究

3、表明，miRNA可在膿毒癥信號通路、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡及器官功能障礙等多個3廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文病理生理過程起調(diào)控作用，參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞部分miRNA的表達(dá)變化明顯，可進(jìn)入血液循環(huán)，成為潛在的膿毒癥分子標(biāo)志物。單核細(xì)胞系在膿毒癥早期炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮主導(dǎo)性的作用，而脂多糖是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要組分，也是目前研究最為透徹的病原相關(guān)分子模式，可通過刺激單核細(xì)胞誘發(fā)膿毒癥早期炎癥反應(yīng)。研究單核細(xì)胞在膿毒癥發(fā)生后miRNA表達(dá)譜的變化，有助于進(jìn)一步明確膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，阻斷膿毒癥的疾病進(jìn)程。目的1.研究THP-1細(xì)胞在LPS刺激下其mi

4、RNA表達(dá)譜的變化。2.為進(jìn)一步研究miRNA對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用提供參考，并尋找可能的診斷性能優(yōu)越的膿毒癥分子標(biāo)志物。內(nèi)容與方法1.培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用THP-1細(xì)胞并傳代，凍存及復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。2.分別以0ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/mlLPS刺激THP-1細(xì)胞，在刺激后6小時、12小時、24小時及48小時收集細(xì)胞上清液，應(yīng)用ELISA法檢測不同LPS刺激濃度、不同刺激時長的細(xì)胞上清液內(nèi)的IL-6水平，探索適宜的炎癥刺激條件。3.實(shí)驗(yàn)組以1000ng/mlLPS刺激THP-1細(xì)胞，對照組只添加R

5、PMI-1640，每組各4個培養(yǎng)孔，48小時后分離培養(yǎng)液及細(xì)胞。ELISA法對培養(yǎng)液內(nèi)的IL-6水平進(jìn)行測定，對細(xì)胞的炎癥反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。4.采用PBS洗液洗滌實(shí)驗(yàn)組與對照組離心后分離得到的細(xì)胞，通過Trizo法提取總RNA并將其轉(zhuǎn)移入2mlEP管內(nèi)，空白對照組4管標(biāo)記1、2、3、4，實(shí)驗(yàn)組4管標(biāo)記5、6、7、8，進(jìn)行妥善的封裝后放置于-80℃冰箱內(nèi)。5.委托博奧生物有限公司進(jìn)行AgilentmiRNAmicroarray芯片檢測，采用AgilentFetureExtraction(v10.7)、AgilentGeneSpring、GeneS

6、pring等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。4LPS刺激對單核細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響結(jié)果1.不同濃度LPS刺激THP1細(xì)胞在不同的時間段細(xì)胞所釋放的IL-6水平不同，刺激濃度越大，IL-6水平越高（P<0.05）。2.從對數(shù)折線圖上可以看出，THP-1細(xì)胞IL-6分泌呈現(xiàn)出高度時間依賴性，刺激24小時以后IL-6水平顯著升高。3.實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，部分miRNA出現(xiàn)顯著改變，實(shí)驗(yàn)組hsa-miR-21-5P、hsa-miR-146a-5P及hsa-miR-29b-3p等部分miRNA出現(xiàn)顯著上調(diào)，hsa-miR-16-5P、hsa-miR

7、-92a-3P、hsa-let-7a-5P等部分miRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著-4-7下調(diào)（所有P值均在10～10之間）。結(jié)論1.內(nèi)毒素脂多糖（LPS）能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放IL-6；2.LPS刺激濃度越大，THP-1細(xì)胞分泌的IL-6水平越高，IL-6在LPS刺激24小時后才出現(xiàn)顯著地上調(diào)；3.受LPS刺激的THP-1細(xì)胞miRNA表達(dá)譜出現(xiàn)變化，部分miRNA出現(xiàn)顯著上調(diào)或下調(diào)。關(guān)鍵詞：脂多糖；膿毒癥；單核細(xì)胞；微小RNA；5廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文ThevariationofmiRNAsexpressedbymonocytewiththes

8、timulationbylipopolysaccharideSepsisisanillnesscharacterizedbysystemicinflammatoryrespons