創(chuàng)傷弧菌膠體金免疫層析試紙條研制

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1、南方醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文創(chuàng)傷弧菌膠體金免疫層析試紙條研制姓名：嚴(yán)智敏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：病理學(xué)指導(dǎo)教師：申洪20110601／煳溯創(chuàng)傷弧菌免疫層析試紙條研制碩士研究生：嚴(yán)智敏指導(dǎo)教師：申洪教授摘要研究背景和目的創(chuàng)傷弧菌(啪riovulnificus，Vv)是弧菌屬第5群細(xì)菌，革蘭氏陰性，彎曲有莢膜的弧菌，主要生長(zhǎng)在海水魚類及貝母類。根據(jù)其生化特性、流行病學(xué)模式以及宿主范圍將其分為I、II、Ⅲ3個(gè)亞型，其中I型Vv是導(dǎo)致人群創(chuàng)傷感染及原發(fā)性敗血癥的病原體。創(chuàng)傷弧菌感染一旦出現(xiàn)敗血癥，其病死率高達(dá)50％以上。原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌感染發(fā)

2、病率呈逐年遞增的趨勢(shì)。國內(nèi)1990年首次報(bào)道一例，隨后沿海各地區(qū)每年都有散發(fā)病例報(bào)道，其病死率一直居高不下。對(duì)本病的認(rèn)識(shí)不足，發(fā)病早期未能正確診斷，或誤診為超敏反應(yīng)而使用大劑量激素，是造成高病死率的主要原因【211。在對(duì)創(chuàng)傷弧菌感染的診斷方面，由于創(chuàng)傷弧菌引起的腹瀉及最初的癥狀并無特異性，因而實(shí)驗(yàn)室診斷成為最可靠的確診手段。目前細(xì)菌性食物中毒(包括創(chuàng)傷弧菌引起的食物中毒)的檢驗(yàn)仍以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為主，但該方法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，一般要經(jīng)過：①增菌；②選擇性增菌；③選擇性平板分離；④生化鑒定；⑤血清學(xué)鑒定。耗時(shí)較長(zhǎng)，往往需要4天～7天

3、甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能作出最終鑒定，且陽性率低，容易造成漏檢。而創(chuàng)傷弧菌感染具有起病急、迅速致死的特點(diǎn)，有臨床資料表明，住院到死亡時(shí)間平均為2天。因此迫切需要建立一種準(zhǔn)確而又迅速的診斷方法。目前已建立了不少創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)技術(shù)，包括常規(guī)及復(fù)合PCR、核酸雜交、生物傳感器以及利用單克隆抗體建立的ELISA、乳膠凝集試驗(yàn)等技術(shù)方法。Parker等建立了以創(chuàng)傷弧菌特異性抗體為基礎(chǔ)的酶免疫法，最低檢出量為2000個(gè)菌／孔，但操作繁瑣，條件要求較多，一般需要中文摘要3-5h才能完成檢測(cè)。PCR檢測(cè)方法的靈敏度高，文獻(xiàn)報(bào)道以創(chuàng)傷弧菌毒力相關(guān)基因vcg

4、為目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)環(huán)境中的創(chuàng)傷弧菌，靈敏度可達(dá)2．5x103CFU／ml，且具有良好的特異性，但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢查所需。能否建立一種快速方便的檢測(cè)方法，及時(shí)準(zhǔn)確地對(duì)創(chuàng)傷弧菌污染及感染進(jìn)行分析，為食品安全及臨床診斷提供有效證據(jù)呢?能否用試紙條對(duì)創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行快速檢測(cè)呢?國內(nèi)外尚未見相應(yīng)方法報(bào)道，為此我們進(jìn)行了研究，目的是建立一種適合于創(chuàng)傷弧菌簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果易于判斷的檢測(cè)方法。方法：1．創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體的純化及鑒定(1)創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27562，購自中國科學(xué)院微生物研究所普通微生物保藏

5、中心。復(fù)蘇培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡觀察，劃線接種于MarieBroth2216瓊脂平板，觀察其菌落形態(tài)。平板培養(yǎng)獲得獲得細(xì)菌，并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算出細(xì)菌濃度，并通過甲醛固定法制備創(chuàng)傷弧菌菌體抗原。(2)以創(chuàng)傷弧菌全菌抗原多次免疫新西蘭大白兔，制備兔抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體。采用辛酸一飽和硫酸銨法對(duì)多克隆抗血清進(jìn)行純化；BCA法檢測(cè)純化后抗體蛋白濃度；SDS．PAGE法檢測(cè)抗體蛋白的純度，與純化前蛋白條帶的變化進(jìn)行比較；PMSF法制備創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白，Western-Blotting法檢測(cè)抗體蛋白與細(xì)菌外膜蛋白免疫反應(yīng)結(jié)果，觀察抗

6、體蛋白的活性；間接ELISA法檢測(cè)純化前后抗體蛋白的效價(jià)的變化。2．膠體金抗體探針的合成(1)根據(jù)試紙條的側(cè)向流動(dòng)和膠體金的示蹤功能，結(jié)合免疫學(xué)方法，建立創(chuàng)傷弧菌免疫層析試紙條。首先制備不同粒徑的膠體金顆粒，采用檸檬酸三鈉還原法，利用不同體積的還原劑制備五種不同粒徑的膠體金顆粒，紫外．可見光分光光度儀對(duì)上述膠體金進(jìn)行400nm～,700nm的光譜掃描，獲得最大的吸收波長(zhǎng)、吸光值以及中位峰寬，并通過最大吸收峰波長(zhǎng)計(jì)算出膠體金顆粒粒徑的大H碩士學(xué)位論文小。觀察不同粒徑膠體金的顏色，透明性及穩(wěn)定性，選擇合適的膠體金顆粒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(2)

7、利用不同體積的K2C03溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值，偶聯(lián)抗體蛋白，檢測(cè)520nm和580nm吸光度A比值，即A520IIIII／_A580咖比值，繪出K2C03體積-吸光度變化曲線，確定最適K2C03的體積；以K2C03調(diào)節(jié)pH后的膠體金溶液，偶聯(lián)不同體積的抗體蛋白，檢測(cè)A520IlI．艙5跚姍比值，繪出蛋白抗體體積一吸光度變化曲線，確定最適抗體蛋白所需量。(3)對(duì)金標(biāo)抗體溶液穩(wěn)定劑及緩沖液進(jìn)行優(yōu)化比較，選擇能有效保持金標(biāo)溶液穩(wěn)定性及活性的條件。3．創(chuàng)傷弧菌快速檢測(cè)試紙條研制(1)將純化的兔抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體和羊抗兔IgG分別

8、包被在硝酸纖維素膜檢測(cè)線和質(zhì)控線上，并經(jīng)封閉液處理，干燥。玻璃纖維素膜浸泡于膠體金．抗體復(fù)合物后，選擇適合的干燥條件。將吸水紙，硝酸纖維素膜，金標(biāo)墊以及樣品墊依次粘貼至膠板上，組裝裁剪成試紙條。對(duì)創(chuàng)傷弧菌膠體金免疫層析試紙條的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，通過對(duì)創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)