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《黃曲霉毒素b1膠體金免疫層析試紙條研制》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要III黃曲霉毒素B1(aflatoxinB,AFBl)是寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)和黃曲霉(A.flavu)的二次代謝產(chǎn)物,具有很強的致癌性。許多糧油食品、飼料等都容易被AFBl污染,嚴重威脅人類健康和畜禽生產(chǎn)。幾乎所有國家和地區(qū)都規(guī)定了農(nóng)產(chǎn)品、食品和飼料中AFBl的最大允許含量,并作為強制性檢測標準進行檢測。目前的檢測方法大多需要專門的儀器設(shè)備并且操作繁瑣,無法滿足現(xiàn)場快速檢測的要求,因此建立簡單、快速、高效的AFBl檢測方法具有重要的意義。本研究以單克隆抗體(McAb)和免疫膠體金標記技術(shù)(ILT)為基
2、礎(chǔ),根據(jù)競爭抑制原理,成功研制了AFBl膠體金免疫層析試紙條,其靈敏度、特異性、穩(wěn)定性等基本能達到檢測要求。(1)將穩(wěn)定分泌抗AFBl單克隆抗體的雜交瘤細胞株2A5接種于BALB/c小鼠腹腔,采用體內(nèi)誘生腹水法制備抗AFBl的腹水。腹水經(jīng)辛酸.硫酸銨法純化并作質(zhì)量鑒定,考馬斯亮藍法測定單抗蛋白質(zhì)濃度為1.526mg/mL;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定抗體效價為1:6.4x104,IC50為0.218n∥mL;交叉反應(yīng)結(jié)果表明單抗特異性良好。(2)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,以金標AFBl單克隆抗體作為探針,將AFBl一BSA(檢測線
3、)和羊抗鼠IgG(質(zhì)控線)分別包被在硝酸纖維素膜上,構(gòu)建了間接競爭膠體金免疫層析檢測體系(GICA)。標記探針中金溶膠最佳粒徑為24姍,最佳包被抗原濃度為0.3酬,金標單抗量為O.5lxg/mL,金標液的最佳稀釋度為4倍稀釋。GICA目測檢出限為5ng/mL,檢測時間為5~10min。試紙條對AFB2、AFMl、赭曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮等無交叉反應(yīng),與AFGl、AFG2有明顯的交叉反應(yīng)。(3)在AFBl加標回收實驗中,將6種不同濃度(1、2、3、5、10、20ng/mL)的AFBl標準品添加到未污染AFBl的玉米粉中,制備不同污染程度的樣
4、品。分析比較GICA法和ELISA法對AFBl的檢測情況。當添加的AFBl濃度低于2ng/mL時,檢測線和質(zhì)控線均為紅色;高于3ng/mL時,僅質(zhì)控線為紅色,同時以ELISA法做驗證實驗,結(jié)果表明試紙條能夠基本滿足檢測要求。試紙條檢測的最大優(yōu)點是無需借助儀器,所需試劑已固定在試紙條上,檢測快速、簡便,lOmin內(nèi)可出檢測結(jié)果,適用于對AFBl進行現(xiàn)場檢測。關(guān)鍵詞:黃曲霉毒素B1;膠體金;免疫層析試紙條Abstrac:tVABSTRACTAflatoxinB1arecarcinogenicsecondarymetabolitesproduce
5、dprimarilybyAspergillusflavusandA.parasiticus.TheyCallbepresentingrains,nuts,cottonseedandothercommoditiesassociatedwithhumanfoodoranimalfeeds.AflatoxinB1hasbeenimplicatedinhumanhealthandanimalfeeds.So,mostcontrollinggovernmentagenciesworldwidehaveregulationsregardingtheam
6、ountofaflatoxinB1allowedinhumanandanimalfoodstuffs,anddetecteditascompellentstandard.ThedetectionmethodsofAFB1nowarecomplicatedtooperateandneedspecialinstruments,whichcannotmeettherequirementofrapiddetectiononthespot.Therefore,developmentofaconvenientandrapidmethodforAFB1d
7、etectionisextremelyimportantandnecessary.Inthisstudy,dotimmunogoldassay(DIGA)basedonmonoclonalantibody(McAb)andimmunogoldlabelingtechnique(ILT)wasdevelopedfortheAFBIdetectionaccordingtocompetitiveinhibitionprinciple.Adoptingvivoculturemethod,hyridomacell2A5capableofsecreti
8、ngMcAbagainstAFB1continually,wereinjectedintoBLAB/cmicetoproduceascites.Theascitesofthemi