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《黃曲霉毒素b1膠體金免疫層析試紙條研制》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要III黃曲霉毒素B1(aflatoxinB，AFBl)是寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)和黃曲霉(A．flavu)的二次代謝產(chǎn)物，具有很強的致癌性。許多糧油食品、飼料等都容易被AFBl污染，嚴重威脅人類健康和畜禽生產(chǎn)。幾乎所有國家和地區(qū)都規(guī)定了農(nóng)產(chǎn)品、食品和飼料中AFBl的最大允許含量，并作為強制性檢測標準進行檢測。目前的檢測方法大多需要專門的儀器設(shè)備并且操作繁瑣，無法滿足現(xiàn)場快速檢測的要求，因此建立簡單、快速、高效的AFBl檢測方法具有重要的意義。本研究以單克隆抗體(McAb)和免疫膠體金標記技術(shù)(ILT)為基
2、礎(chǔ)，根據(jù)競爭抑制原理，成功研制了AFBl膠體金免疫層析試紙條，其靈敏度、特異性、穩(wěn)定性等基本能達到檢測要求。(1)將穩(wěn)定分泌抗AFBl單克隆抗體的雜交瘤細胞株2A5接種于BALB／c小鼠腹腔，采用體內(nèi)誘生腹水法制備抗AFBl的腹水。腹水經(jīng)辛酸．硫酸銨法純化并作質(zhì)量鑒定，考馬斯亮藍法測定單抗蛋白質(zhì)濃度為1．526mg／mL；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定抗體效價為1：6．4x104，IC50為0．218n∥mL；交叉反應(yīng)結(jié)果表明單抗特異性良好。(2)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，以金標AFBl單克隆抗體作為探針，將AFBl一BSA(檢測線
3、)和羊抗鼠IgG(質(zhì)控線)分別包被在硝酸纖維素膜上，構(gòu)建了間接競爭膠體金免疫層析檢測體系(GICA)。標記探針中金溶膠最佳粒徑為24姍，最佳包被抗原濃度為0．3酬，金標單抗量為O．5lxg／mL，金標液的最佳稀釋度為4倍稀釋。GICA目測檢出限為5ng／mL，檢測時間為5～10min。試紙條對AFB2、AFMl、赭曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮等無交叉反應(yīng)，與AFGl、AFG2有明顯的交叉反應(yīng)。(3)在AFBl加標回收實驗中，將6種不同濃度(1、2、3、5、10、20ng／mL)的AFBl標準品添加到未污染AFBl的玉米粉中，制備不同污染程度的樣
4、品。分析比較GICA法和ELISA法對AFBl的檢測情況。當添加的AFBl濃度低于2ng／mL時，檢測線和質(zhì)控線均為紅色；高于3ng／mL時，僅質(zhì)控線為紅色，同時以ELISA法做驗證實驗，結(jié)果表明試紙條能夠基本滿足檢測要求。試紙條檢測的最大優(yōu)點是無需借助儀器，所需試劑已固定在試紙條上，檢測快速、簡便，lOmin內(nèi)可出檢測結(jié)果，適用于對AFBl進行現(xiàn)場檢測。關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1；膠體金；免疫層析試紙條Abstrac：tVABSTRACTAflatoxinB1arecarcinogenicsecondarymetabolitesproduce
5、dprimarilybyAspergillusflavusandA．parasiticus．TheyCallbepresentingrains，nuts，cottonseedandothercommoditiesassociatedwithhumanfoodoranimalfeeds．AflatoxinB1hasbeenimplicatedinhumanhealthandanimalfeeds．So，mostcontrollinggovernmentagenciesworldwidehaveregulationsregardingtheam
6、ountofaflatoxinB1allowedinhumanandanimalfoodstuffs，anddetecteditascompellentstandard．ThedetectionmethodsofAFB1nowarecomplicatedtooperateandneedspecialinstruments，whichcannotmeettherequirementofrapiddetectiononthespot．Therefore，developmentofaconvenientandrapidmethodforAFB1d
7、etectionisextremelyimportantandnecessary．Inthisstudy,dotimmunogoldassay(DIGA)basedonmonoclonalantibody(McAb)andimmunogoldlabelingtechnique(ILT)wasdevelopedfortheAFBIdetectionaccordingtocompetitiveinhibitionprinciple．Adoptingvivoculturemethod,hyridomacell2A5capableofsecreti
8、ngMcAbagainstAFB1continually,wereinjectedintoBLAB／cmicetoproduceascites．Theascitesofthemi
