wfs1在大鼠胰腺發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)

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1、南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章引言胰腺主要行使兩種生物學(xué)功能：產(chǎn)生消化酶；分泌四種內(nèi)分泌激素(胰島素．insulin、胰高糖素．glucagon、生長(zhǎng)激素抑制素．somatostatin、胰多肽一pancreaticpolypeptide)以調(diào)節(jié)血糖的動(dòng)態(tài)平衡。而這些功能的發(fā)揮依賴于完整的胰腺結(jié)構(gòu)：腺泡和導(dǎo)管組成的胰腺外分泌部是消化酶產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；四種內(nèi)分泌細(xì)胞(僅、p、6、PP細(xì)胞)組成的內(nèi)分泌胰腺即胰島是血糖調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(n。正是由于胰腺的重要生物學(xué)功能，胰腺發(fā)育一直都是發(fā)育生物學(xué)家關(guān)注和研究的焦點(diǎn)之一。胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足引

2、起糖尿病，有些糖尿病患者的胰島結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，糖尿病發(fā)病率的不斷上升使得對(duì)胰腺發(fā)育尤其是胰島形成過程的研究顯得更為重要佇-4)．胰腺起源于胚胎內(nèi)胚層上皮細(xì)胞，大鼠胰腺在胚胎8．5天(E8．5)左右開始發(fā)育，E10．5背側(cè)胰芽和腹側(cè)胰芽開始融合，導(dǎo)管上皮細(xì)胞開始分化為p細(xì)胞；E12．5天大鼠胚胎胰腺中僅存在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，前者是胰腺發(fā)育的根源，而后者為胰腺的發(fā)育提供了空間環(huán)境；E14胰腺導(dǎo)管上皮分化為腺泡，內(nèi)分泌細(xì)胞僅、13、6細(xì)胞分化成熟，能夠分泌胰島素和胰高血糖素等；E15．5左右分化成熟的內(nèi)分泌細(xì)胞開始突破基底膜向周圍問充

3、質(zhì)遷移，內(nèi)分泌細(xì)胞相互聚集，伐、6、PP．缸／胞圍繞p細(xì)胞形成胰島結(jié)構(gòu)；E18．5周圍腺泡結(jié)構(gòu)逐漸清晰，典型胰島結(jié)構(gòu)基本形成并不斷完善成熟直至出生后(5期。出生后兩周內(nèi)，內(nèi)分泌細(xì)胞大量凋亡，隨后的一周內(nèi)內(nèi)分泌細(xì)胞大量增生。到出生z．21；K．(P21)哺乳期結(jié)束，胰島完成結(jié)構(gòu)重塑和功能成熟(10-11)。南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文WFSl基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白，cDNA全長(zhǎng)2742bp，分子量100KDa。Wolfram綜合征是一種以少年時(shí)發(fā)生糖尿病，并且伴發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)病變，如視神經(jīng)萎縮，神經(jīng)性耳聾等為特征的一種常染色體隱性遺

4、傳疾病(12-13)。wFSl編碼wolframin蛋白，基因的突變導(dǎo)致Wolfram綜合征的發(fā)生(14-15)。Wolframin功能尚不完全明確，可能屬于一種新家族。研究表n凋WFSl蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子平衡，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能力，維持細(xì)胞分裂周期等(16-18)。在胰腺中有研究表明它在對(duì)成年小鼠維持D細(xì)胞數(shù)量以及對(duì)胰島素分泌起到重要作用(19)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)實(shí)際加工未折疊蛋白的能力與需求的不平衡時(shí)就產(chǎn)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。應(yīng)激產(chǎn)生后會(huì)出現(xiàn)一種適應(yīng)性反應(yīng)，未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，是由多種因子組成的信號(hào)通路。研究表明WFSl是UPR信號(hào)通路的組成

5、之一，是XBP一1的下游基因(m。到目前為止，圍繞WFSl的研究主要集中在成年胰島素分泌及其可能機(jī)制，胚胎發(fā)育未有涉及。本研究首次在大鼠胰腺不同發(fā)育階段檢測(cè)WFSl的表達(dá)，為研究WFSl在胰腺發(fā)育中的作用提供線索。本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)到在大鼠胰腺發(fā)育過程中，WFSlmRNA的表達(dá)高峰出現(xiàn)在胰島形成的關(guān)鍵階段，即胚胎15．5天至胚胎18．5天，RT-PCR的結(jié)果驗(yàn)證了這樣的表達(dá)趨勢(shì)。另外，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫印跡技術(shù)確立WFSl在大鼠胰腺不同發(fā)育階段的蛋白差異表達(dá)，AkEl5．5：虱]E18．5、AKP0：至)J成年表達(dá)量逐步遞增；運(yùn)用免疫

6、組織化學(xué)技術(shù)確定了WFSl在不同發(fā)育時(shí)期胰腺的組織定位，WFSl蛋白在不同發(fā)育時(shí)期的內(nèi)分泌胰腺p細(xì)胞都有表達(dá)，而且首次發(fā)現(xiàn)WFSl在南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文間充質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)表達(dá)。6南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文材料與試劑(一)試劑：第二章材料與方法TRIzOlReagentInvitrogenLifeTechnologiesRNeasyMiIliK“QIAGENSuperScriptIIInvitrogenLifeTechnologiesT7_Oligo(dT)24PrimerOperonEcoliDNALigaseNEBEcoliDNAPoly

7、meraseINEBE．coliRnaseHInvitrogenLifeTechnologiesT4DNAPolymeraseNEB5XSecondstrandbufferInvitrogenLifeTechnologies10mMdNTPInvitrogenLifeTechnologiesPhaseLockGelEppendorfPhenol／chloroform／isoamylalcoholArnbionEnzoRNATranscriptLabelingKitAffymetrixRNeasyMiIliKit(usedinIVTclea

8、nup)QIAGENDEPC．T托atedwaterAmbionTrizmaBaseSigma-AldrichMagnesiumacetate(MgOAc)Sigma-AldrichPotas