rkip在肝星狀細(xì)胞粘附過程中的作用

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1、河北醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文RKIP在肝星狀細(xì)胞粘附過程中的作用姓名：趙慧申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：姜慧卿201203中文摘要RKIP在肝星狀細(xì)胞粘附過程中的作用摘要肝纖維化是慢性肝病發(fā)展為肝硬化乃至肝功能衰竭的病理基礎(chǔ)，’因而，阻止肝纖維化發(fā)生這一過程已經(jīng)成為國內(nèi)外研究慢性肝病的中心議題。在這一過程中細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)的生成和降解失衡，其量和質(zhì)發(fā)生變化，從以IV型膠原組成為主，變?yōu)橐岳w維膠原組成為主(如I型、III型膠原)。由此肝臟的質(zhì)地、韌度及血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，使肝功能出現(xiàn)異常，并且可能引起多種并發(fā)癥。肝星

2、狀細(xì)胞(Hepaticstellatecells，HSCs)在肝纖維化過程中被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，生成細(xì)胞外基質(zhì)及一系列生長因子、促炎因子，這奠定了HSCs在肝纖維化過程中的中心地位。因此，干預(yù)HSCs、影響其生物學(xué)行為是阻斷、減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的研究切入點(diǎn)。Raf激酶抑制蛋白(Rafkinaseinhibitorprotein，RKIP)是1999年被YeungK等利用酵母雙雜交篩選法分離出的一種Raf激酶抑制蛋白，它可以與Raf-1結(jié)合抑制其磷酸化MEK，從而抑制Ra￡1／ME剛ERKl，2信號通路的激活，進(jìn)而可以影響HSCs的增殖分化等生物學(xué)行為。近

3、年來RKIP在癌癥中的功能和作用研究較多，同時(shí)國內(nèi)有研究證實(shí)RKIP可以抑制HSCs細(xì)胞的增殖，促進(jìn)HSCs的細(xì)胞遷移。本研究我們將揭示RKIP在HSCs粘附過程中的作用。目的：本文主要通過RKIP過表達(dá)及RNAi技術(shù)，模擬不同生理病理狀態(tài)下ECM成分的改變，探討RKIP對HSCs粘附功能的影響。方法：實(shí)驗(yàn)LX．2細(xì)胞共分四組，分別是RKIP過表達(dá)組(鼬qP—Ad)及陰性對照組(GFP．Ad)；應(yīng)用用RNAi技術(shù)的RKIP抑制組(RKIP．RNAi．Ad)及陰性對照組(NC．GFP．Ad)。首先確定細(xì)胞感染病毒的最適MOI(multiplicityofinfect

4、ion)值：體外培養(yǎng)傳代LX．2細(xì)胞株，72h傳代一次。當(dāng)細(xì)胞融合至80％左右時(shí)開始給予感染病毒，MOI值設(shè)四個(gè)水平，分別是5、lO、15、．20。于12h、24h、48h時(shí)在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，計(jì)數(shù)細(xì)胞熒光數(shù)，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行感染率的驗(yàn)證，篩選出最適MOI值及感染時(shí)間。其次確定感染病毒后是否確有RKIP的中文摘要過表達(dá)和抑制：以最適MOI值及感染時(shí)間感染細(xì)胞，WesternBlot方法驗(yàn)證各組RKIP表達(dá)情況。應(yīng)用透射電鏡觀察細(xì)胞間連接。已干預(yù)好的細(xì)胞稀釋成1．0×105／ml的濃度種在蓋玻片和己準(zhǔn)備好的由I型膠原、IV型膠原、matrigel及fi

5、bronectin包被的24孔板中，每種干預(yù)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，1h后200×下取12個(gè)視野計(jì)數(shù)粘附的細(xì)胞數(shù)，資料數(shù)據(jù)以均數(shù)4-標(biāo)準(zhǔn)差(硅s)表示，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：1人HSCsLX一2細(xì)胞株的腺病毒感染率可達(dá)到80％～90％。適宜的MOI值為5，感染時(shí)間為48h。感染時(shí)間過短，熒光表達(dá)率低；MOI值過大則細(xì)胞毒性過大，細(xì)胞狀態(tài)變差，甚至碎裂。2RKIP過表達(dá)組較對照組蛋白表達(dá)增多(3．474-0．02w1．74+0．13，P<0．05，n=3)。RKIP抑制組較對照組蛋白表達(dá)明顯減少(0．294-0．06VS0．734-0．14，P<0．05，n=3)。3RKIP過表

6、達(dá)促進(jìn)HSCs在glass上的粘附，過表達(dá)組和抑制組的粘附細(xì)胞數(shù)分別為(158士68VS814-12，P<0．05，n=12)。RKIP的低表達(dá)，抑制其在glass上的粘附(83士10"gS131士43，P<0．05，n=12)；RKIP在HSCs與基質(zhì)的粘附上的作用與在glass上的作用相反。RKIP的過表達(dá)抑制HSCs與matrigel、I型膠原、IV型膠原及纖維連接蛋白的粘附。Matrigel上RKIP過表達(dá)組與對照組分別為(80a：14VS1524-42，P<0．05，n-12)；I型膠原上為(704-13Ⅷ1384-36，P<0．05，n=12)；IV型

7、膠原(92a：6Ⅷ124士32，P

8、glass