肝星狀細(xì)胞和枯否細(xì)胞在肝纖維化過程中的相互作用

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1、肝星狀細(xì)胞和枯否細(xì)胞在肝纖維化過程中的相互作用InteractionbetweenHepaticStellateCellandKupfferCellinLiverFibrosis作者姓名：張玉姣專業(yè)名稱：內(nèi)科學(xué)研究方向：炎癥和肝纖維化的關(guān)系及機(jī)制指導(dǎo)教師：遲寶榮教授學(xué)位類別：醫(yī)學(xué)博士培養(yǎng)單位：白求恩第一醫(yī)院論文答辯日期：2015年6月7日授予學(xué)位日期：年月日論文評(píng)閱人答辯委員會(huì)組成姓名職稱工作單位姓名職稱工作單位賈繼東教授首都醫(yī)科大學(xué)附屬北主席金寧一教授中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科京友誼醫(yī)院學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所趙作偉教授大連醫(yī)科大學(xué)二附院委員遲寶榮教授吉林大學(xué)第一醫(yī)院段志軍教授大連醫(yī)科大學(xué)一附

2、院李玉新教授東北師范大學(xué)劉冰熔教授哈爾濱醫(yī)科大學(xué)二附院王麗穎教授吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院王邦茂教授天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院孟祥偉教授吉林大學(xué)第一醫(yī)院王炳元教授中國(guó)醫(yī)科大學(xué)一附院許鐘鎬教授吉林大學(xué)第一醫(yī)院中文摘要肝星狀細(xì)胞和枯否細(xì)胞在肝纖維化過程中的相互作用背景：病毒、酒精、寄生蟲等多種病因都可以導(dǎo)致肝臟纖維化。去除或控制病因可以從一定程度上控制疾病的進(jìn)展，但部分肝纖維化持續(xù)存在。了解肝纖維化的機(jī)制是控制肝纖維化進(jìn)展及逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵。肝纖維化是肝臟損傷修復(fù)失衡的結(jié)果。在這個(gè)過程中，主要涉及兩個(gè)重要的細(xì)胞：肝星狀細(xì)胞和枯否細(xì)胞。肝星狀細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，它的激活和凋亡是肝纖維化的進(jìn)展和逆

3、轉(zhuǎn)的核心環(huán)節(jié)?？莘窦?xì)胞是肝臟固有免疫的重要組成部分，在肝臟的損傷和修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，二者都位于肝臟的竇周隙。二者從功能上、空間上對(duì)肝纖維化的作用使二者成為研究的焦點(diǎn)。目的：1.研究健康和纖維化的人體肝臟內(nèi)的炎癥情況與纖維化情況，以及肝星狀細(xì)胞的活化情況和枯否細(xì)胞的聚集情況；2.研究誘導(dǎo)過程中的巨噬細(xì)胞和誘導(dǎo)成功后的巨噬細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞細(xì)胞系LX-2細(xì)胞激活的影響，以及LX-2細(xì)胞對(duì)兩種不同的巨噬細(xì)胞的激活及功能的影響。材料與方法：1.肝臟組織和肝臟灌洗液來自于行肝移植手術(shù)的供體和受體，其中，硬化肝臟來自行肝移植手術(shù)的受體，正常肝臟來自于行肝移植手術(shù)的供體。由于從人肝組織中獲得

4、星狀細(xì)胞和枯否細(xì)胞的數(shù)量有限，我們用人肝星狀細(xì)胞的細(xì)胞系（LX-2細(xì)胞）來代替肝星狀細(xì)胞；用外周血分離出來的單核細(xì)胞誘導(dǎo)出的巨噬細(xì)胞來代替枯否細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中用到的外周血購(gòu)自長(zhǎng)春市中心血站。2.采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)來觀察肝臟的炎癥狀況（IL-1β,IL-6,IL-10,IIL-12,TNF-α）和纖維化（α-SMA,Col1A1,TIMP-1）狀況；用免疫組織化學(xué)方法來研究肝星狀細(xì)胞（α-SMA）和枯否細(xì)胞（CD68）在肝臟內(nèi)的差異。3.實(shí)驗(yàn)中采用單核-巨噬集落刺激因子和巨噬細(xì)胞集落刺激因子來分別誘導(dǎo)M1和M2型巨噬細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的表型，用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸

5、附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌。4.肝臟內(nèi)的枯否細(xì)胞部分是從外周血中補(bǔ)充而來，誘導(dǎo)過程中的巨噬細(xì)胞與LX-2細(xì)胞的相互作用則模擬這個(gè)過程。肝臟內(nèi)的枯否細(xì)胞部分是駐扎在肝臟血竇的固有細(xì)胞，它的表型隨著肝臟內(nèi)環(huán)境的改變而改變，誘導(dǎo)成功后的巨噬細(xì)胞與LX-2細(xì)胞的相互作用則模擬這個(gè)過程。我們分別用誘導(dǎo)過程中的巨噬細(xì)胞和誘導(dǎo)成功后的巨噬細(xì)胞與LX-2細(xì)胞按照1:5的比例進(jìn)行共培養(yǎng)。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的表型，用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌。結(jié)果：1.在纖維化肝臟中，促炎性基因（IL-1β,IL-6,IL-12,TNF-α）表達(dá)增高，抗炎性基因（IL-10）表

6、達(dá)降低，纖維化相關(guān)基因表達(dá)（α-SMA,Col1A1,TIMP-1）也增高。多元回歸相關(guān)性分析表明，促炎性基因的表達(dá)與纖維化相關(guān)基因的表達(dá)呈正相關(guān)，抗炎性基因的表達(dá)與纖維化相關(guān)基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，但與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解的酶MMP-2沒有相關(guān)性。此外，在纖維化肝臟中，激活的星狀細(xì)胞的數(shù)量和聚集的枯否細(xì)胞的數(shù)量較正常肝臟要多。2.M1型巨噬細(xì)胞呈油煎蛋樣，可以高表達(dá)和分泌促炎性細(xì)胞因子IL-6,IL-12和TNF-α,抗炎性細(xì)胞因子IL-10較低；而M2型巨噬細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀，高表達(dá)和分泌抗炎性細(xì)胞因子IL-10，促炎性細(xì)胞因子IL-6,IL-12,TNF-α則相反。3.誘導(dǎo)過程中的巨噬細(xì)胞，無

7、論是向M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)，還是向M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)，都可以促進(jìn)LX-2細(xì)胞表達(dá)纖維化相關(guān)基因（α-SMA,Col1A1,TIMP-1）和調(diào)節(jié)纖維化的基因（MMP-2,MMP-9），且二者沒有明顯差異。LX-2細(xì)胞可以影響巨噬細(xì)胞的極化過程，無論是向M1型巨噬細(xì)胞極化，還是向M2型巨噬細(xì)胞極化，都表現(xiàn)出相似的表型和功能。4.誘導(dǎo)成功后的巨噬細(xì)胞，無論是向M1型誘導(dǎo)，還是M2型誘導(dǎo)，都可II以促進(jìn)LX-2細(xì)胞表達(dá)纖維化相關(guān)基因（α-SM