rkip相互作用蛋白在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究

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1、分類號(hào)VDC博士學(xué)位論文密級(jí)RKIP相互作用蛋白在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究T。mechanismesearchofproteinsthatllemecllanismresearch0IDroteinsthatlinteractwiththenovelgastriccancerrelatedprotein瑚P作者姓名：谷歡學(xué)科專業(yè)：內(nèi)科學(xué)學(xué)院(系、所)：湘雅醫(yī)院指導(dǎo)老師：張桂英教授論文答辯日期三翌三羔鄉(xiāng)答辯委員會(huì)主席中南大學(xué)二0一二年五月原創(chuàng)性聲明本人聲明，所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以

2、標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中南大學(xué)或其他單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對(duì)本研究所作的貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說明。作者簽名：二疊呈墾．日期：迎年￡月旦日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人了解中南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并根據(jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學(xué)位論文，允許學(xué)位論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用復(fù)印、縮印或其它手段保存學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡(luò)向社

3、會(huì)公眾提供信息服務(wù)。作者簽名：簽墼導(dǎo)師簽名蘭絲篁笙荔日期：坦年上月翌日博士學(xué)位論文中文摘要研究背景：胃癌(gastriccancer，GC)是目前世界上發(fā)病率第四位的腫瘤，居消化道惡性腫瘤發(fā)病率及病死率之首‘1。21。全世界每年有750000患者死于胃癌，我國每年有16萬人死于胃癌。迄今為止，胃癌的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚。在胃癌的防治中胃癌早期診斷、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)和預(yù)后評(píng)估具有重要作用。尋找新的腫瘤標(biāo)志物及基因治療靶點(diǎn)成為當(dāng)務(wù)之急。RKIP是一種高度保守、廣泛表達(dá)、具有多種生理與病理功能的小分子胞漿蛋白。RKIP又名PEBPl(磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1)，近期研

4、究‘3‘61發(fā)現(xiàn)其表達(dá)下調(diào)或缺失在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，因此RKIP在惡性腫瘤中的作用機(jī)制已經(jīng)成為腫瘤領(lǐng)域一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Raf激酶抑制蛋白(Rafkinaseinhibitorprotein)即RKIP在胃癌中存在表達(dá)下調(diào)或缺失，其表達(dá)改變可能與胃癌的發(fā)生、分化、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有關(guān)‘71，但是RKIP在胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制國內(nèi)外均未見報(bào)道。有研究認(rèn)為細(xì)胞中絕大多數(shù)酶的功能和調(diào)控過程是由蛋白質(zhì)復(fù)合體或蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的。因此我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上，應(yīng)用親和純化耦聯(lián)質(zhì)譜為主的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分離、鑒定胃癌細(xì)胞SG

5、C7901中RKIP相互作用蛋白，以探討RKIP抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理，為胃癌的早期診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)及靶向基因治療提供依據(jù)和新的線索。本課題受國家自然科學(xué)基金I(No．81072038)項(xiàng)目資助。博士學(xué)位論文中文摘要第一章pCDNA3．1一PEBPl-3xFLAG表達(dá)載體構(gòu)建目的：構(gòu)建3xFLAG標(biāo)記的PEBPI(BPRKIP)融合蛋白表達(dá)載體。方法：(1)根據(jù)Sigma公司的p3xFLAG．CMV-14載體上對(duì)應(yīng)序列合成3XFLAG；(2)PCR擴(kuò)增PEBPlCDS區(qū)，同時(shí)引入3)(FLAG標(biāo)簽；(3)用HindlII和XhoI將PEBPl．3xF

6、LAG的PCR片段及目的載體pCDNA3．1(+)雙酶切，然后進(jìn)行連接。酶切、測(cè)序等鑒定重組質(zhì)粒；(4)測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌，擴(kuò)增并大量提取質(zhì)粒。結(jié)果：(1)成功合成3xFLAG序列；(2)將3xFLAG標(biāo)簽序列引入PEBPl基因序列C端，雙酶切鑒定克隆正確；(3)將聯(lián)合基因片段連接至pCDNA3．1載體，并測(cè)序證實(shí)基因片段序列完全正確。結(jié)論：成功構(gòu)建融合基因載體pCDNA3．1．PEBPl．3xFLAG。關(guān)鍵詞：PEBPl，RKIP,3xFLAG第二章RKIP相互作用蛋白的篩選目的：分離、鑒定胃癌SGC7901細(xì)胞中RKIP相互作用蛋白，

7、驗(yàn)證RKIP與HSP90、keratin、14．3．3的相互作用。初步研究RKIP抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理，為胃癌的早期診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)以及靶向基因治療提供依據(jù)和新的線索。方法：(1)通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將pcDNA3．1．RKIP．3xFLAG融合表達(dá)II博士學(xué)位論文中文摘要載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至SGC7901細(xì)胞，RT-PCR和Westemblotting分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中RKIPmRNA和蛋白表達(dá)水平；(2)利用3xFLAG標(biāo)簽的親和層析技術(shù)提純RKIP蛋白復(fù)合體；1D．SDS．PAGE技術(shù)預(yù)分離蛋白復(fù)合體；(3)ESI．Q．TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定RKIP相互

8、作用蛋白質(zhì)；(4)數(shù)據(jù)庫查詢及蛋白質(zhì)GO功能聚類分析。(5)大量收集SGC790