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1、第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文抗蓖麻毒素雙可變區(qū)抗體的構(gòu)建和機(jī)制研究姓名：張?zhí)斐缮暾垖W(xué)位級別：碩士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：寇庚201205抗蓖麻毒素雙功能抗體的功能和機(jī)制研究摘要蓖麻毒素是存在于蓖麻籽油【}I的植物毒素。這種毒索由A和B兩個(gè)亞基組成，并通過一條二硫鍵連接在一起。蓖麻毒素B亞基是一種半乳糖特異性的凝集素，能夠結(jié)合細(xì)胞表面含糖脂或糖蛋白的受體。這些結(jié)合的毒素隨后通過宿主細(xì)胞依賴的內(nèi)化機(jī)制和從內(nèi)吞小體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逆向運(yùn)輸機(jī)制被運(yùn)入細(xì)胞質(zhì)。在進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，蓖麻毒素必須在蛋白質(zhì)-硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的作用下，將A，B亞基間的二硫鍵還原，此后
2、A亞基才能露出其酶活性位點(diǎn)。當(dāng)R]rA轉(zhuǎn)移到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，它的糖苷酶活性位點(diǎn)能夠識別rRNA上高保守的Q．sarcin環(huán)，阻礙多肽延伸并導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。因?yàn)槠渚哂懈咧滤篮鸵子谏⒉カ@得的特性，蓖麻毒素被認(rèn)為是一種可能被用于生化攻擊的生物戰(zhàn)劑。目前，盡管已經(jīng)有許多中針對這一威脅的治療方法以及被發(fā)展出來，但特異性的抗體治療仍舊是一種最特異和最高效的治療方法。之前曾經(jīng)有報(bào)道稱兩株或更多單克隆抗體的聯(lián)合使用能夠增加抗體的保護(hù)效果，同時(shí)，我們在制備抗蓖麻毒素肇克隆抗體的過程中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。當(dāng)我們將兩株抗R]rA的單克隆抗體6C2和抗RTB的單克隆抗體
3、3El聯(lián)合使用后，我們發(fā)現(xiàn)抗體的在體內(nèi)和體外的保護(hù)水平部得到了提高。在過去十年中隨著對傳統(tǒng)抗體臨床知識的成熟，人們丌始試圖發(fā)展ff{F一代抗體以期提高抗體的效果。下一代抗體的種類有許多，而雙特異性抗體是其中最受重視的一種。雙特異性抗體一個(gè)火鍵的能力是能夠一個(gè)分子同時(shí)中和保護(hù)兩個(gè)不同的目標(biāo)，例如配體，受體，或細(xì)胞因子。除此之外，雙特異抗體還能通過識別一個(gè)抗原分子上的不同表位來增加抗原特異性和保護(hù)效果。在我們的課題中，我們設(shè)計(jì)了一種含有6C2和3El可變區(qū)和人Fc區(qū)的雙特異性抗體，具有?個(gè)臂結(jié)合兩個(gè)抗原的能力，我們稱之為DVD抗體。在隨后的工作中
4、，我們證實(shí)這種新的DVD抗體保留了親源抗體所有的特性和功能：包括識別R]rA和lHB的能力，阻礙R1’A酶活‘
5、，￡的能力，阻礙l玎B結(jié)合細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂的能力。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和小鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示DVD抗體，其保護(hù)作用有Ⅲj512的提高：比單個(gè)抗體的保護(hù)效果至少多了10倍，甚至比嵌合的6C2和3El的聯(lián)合使用效果還好了3倍。結(jié)合棚同表位的抗體的效果。般被認(rèn)為與抗原抗體之間的親和力有關(guān)。然而，和我們的發(fā)現(xiàn)不同的足，DVD抗體和6C2抗體，3E1抗體的動力學(xué)參數(shù)之問并沒有特別人的芹別。所以，蟊i此后的研究中我們合理的質(zhì)疑DVD抗體I叮能還通過?些
6、je他我們所／fi欠
7、l道的機(jī)制保護(hù)機(jī)體免受毒素攻。lj。RICIN發(fā)揮作川的必籃條什是細(xì)胞質(zhì)-}，游離R1’A的存相：。個(gè)毒索n：內(nèi)質(zhì)p69中陽內(nèi)質(zhì)}叫外釋放R’rA的過檸tf-，PI)I對R，I'A．RTIjM。：硫鍵的解離址je天鍵步驟。I)VI)平【J兩株f‘統(tǒng)Irf{J幣．免隆機(jī)體之11IJ最人的艿：別是他能夠川·個(gè)抗體佻¨時(shí)抓化R，I’人和第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文R1’B。隨后，我們在無細(xì)胞體系中用westemblot和SRP分析證實(shí)了DVD抗體能夠?qū)е骆滈g二硫鍵無法被還原。除此之外，還有一個(gè)明顯的證據(jù)就是DVD抗體能夠使觚A在內(nèi)
8、質(zhì)網(wǎng)中滯留，而其他的抗體包括6C2和3E1抗體的聯(lián)合應(yīng)用都不能引起相同結(jié)果。基于以上結(jié)果，我們認(rèn)為當(dāng)DVD抗體和毒素一起被吸收進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)，二硫鍵被PDI還原的過程被DVD干擾了。這應(yīng)該是DVD抗體動力學(xué)數(shù)據(jù)和單個(gè)抗體類似，但保護(hù)效果優(yōu)-J：其他抗體的合理解釋。關(guān)鍵字：蓖麻毒素雙特異性抗體雙功能抗體蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶抗蓖麻毒素雙功能抗體的功能和機(jī)制研究AbstractRicinisakindofplanttoxinproducedintheseedsofthecastoroilThetoxinconsistsoftwosubunits(Aan
9、dB)linkedbyadisulndebridge．TheB—chain(R『rB)isagalactose-specinclectinwhichbindstothecelIsurface．Thesebindingtoxinsdependonhostcellmachine叮forintemalization，retrogradetra伍ckingfromendosomestotheER．InendoplaSmicReticulum，A—chain(fU’A)can’lreIeaseastericactiVesiteunlesstheinte
10、rchaindisuIndebondsarereducedbyProteindisulphide—isomeraSe(PDI)．whenR1’Aistr蚴sloca
