抗cd45單克隆抗體可變區(qū)基因的克隆與序列分析

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1、·獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明，本學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果的總結(jié)。盡我所知，除文中已經(jīng)標明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本人將承擔本聲明引起的一切法律后果。學位論文作者簽名：日期：年月日學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解學校有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)華中科技大學可

2、以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。保密?，在_____年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密?。（請在以上方框內(nèi)打“v”）學位論文作者簽名：楊娟指導教師簽名：沈關(guān)心教授日期：年月日日期：年月日····華中科技大學碩士學位論文（2008）抗CD45單克隆抗體可變區(qū)基因的克隆及序列分析碩士研究生：楊娟導師：沈關(guān)心教授華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室中文摘要目的抗CD45單克隆抗體可變區(qū)基因的克隆及序列分析，為進一步的基因工程抗

3、體改造研究奠定基礎(chǔ)。方法1.雜交瘤細胞總RNA的提?。阂援惲蚯杷犭遥椒樱确路ㄌ崛】俁NA。2.引物的設(shè)計：利用V區(qū)N端相對保守的特點，根據(jù)Ig可變區(qū)的序列，在N端和恒定區(qū)CH1合成5’和3’端兼并的“通用”引物。3.McAbV區(qū)基因的擴增：以RNA為模板，采用cDNA合成試劑盒合成第一條鏈cDNA，以cDNA為模板，用TaqDNA酶擴增McAbV區(qū)基因。4.V區(qū)基因核苷酸序列分析：用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物后，將McAb的VH基因和VL基因分別與pGEM-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR鑒定陽性

4、菌。每一種連接產(chǎn)物挑取3個陽性菌進行序列分析。5.利用DNAtools，IMGT/QUEST及EBITOOLS:ClustalW2分析軟件對輕鏈和重鏈基因分別進行同源性比較。結(jié)果1.第一次PCR用2條重鏈上游引物（MH1,MH2），一條下游引物（IgG1-C3’）；輕2····華中科技大學碩士學位論文（2008）鏈上(MK)下(Kc)游各一條引物進行擴增，測序結(jié)果獲得編碼單克隆抗體可變區(qū)的核苷酸序列。含引物的VH長397bp，VL長377bp，此次擴增出的基因序列無信號肽序列，適于ScFv的構(gòu)建，進一步以更換

5、引物進行二次PCR，來擴增含信號肽序列的基因。2.第二次PCR用3條重鏈上游（VH5’1，2，3），一條下游引物（IgG1-C3’）；3條輕鏈上游（VL5’1，2，3）引物,下游引物(Kc)進行擴增，測序結(jié)果：VH為有功能的基因片段,長348bp，編碼116個氨基酸，在VH前有57bp的信號肽序列，編碼19個氨基酸；含引物的V?長369bp，擴增的為非功能性V?鏈。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)擴增出非功能輕鏈的上游引物為VL5’1，為了擴增出有功能的輕鏈基因，需重新設(shè)計引物。3.第三次PCR用新合成的VL5’4，5取代原輕鏈上

6、游引物VL5’1，用4條輕鏈上游引物（VL5’2，3，4，5），新合成下游引物（VL3’1），擴增出的V?核苷酸序列長333bp，編碼111個氨基酸，在V?前有57bp的信號肽序列，編碼19個氨基酸，經(jīng)IMGT/QUEST系統(tǒng)分析為有功能的輕鏈基因。對所擴增的Ig基因進行同源性比較結(jié)果：抗CD45單抗有功能的輕鏈均屬于IG?V1-117’01家族；功能性重鏈屬于IGHV2-9-1’01家族。其中擴增出的非功能的輕鏈屬于IG?V3-12’01家族。結(jié)論成功獲取抗CD45單抗的輕鏈與重鏈基因，以及含有信號肽的基因

7、，為進一步通過基因工程技術(shù)改造抗體奠定了良好的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞單克隆抗體；VH，VL基因克隆；序列分析；3····華中科技大學碩士學位論文（2008）CloningofAnti-CD45MonoclonalAntibodyandAnalysisofTheirSequencesAbstractObjectiveTocloneanti-CD45monoclonalantibodyvariableregiongenefragmentsandanalysistheirsequences,laythefurtherfoun

8、dationformodificationofgeneengineeringantibodiesstudy.Methods1.TotalRNAextractionfromhybridomacell:useguanidineisothiocyanate-phenol-chloroformtoextractthetotalRNA.2.Primerdesign:cloninghumanandmouseIg