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1、抗遲緩愛德華菌獨特型單克隆抗體重鏈可變區(qū)基因的克隆及序列分析作者：秦紅,黃威權，楊向民,溫偉紅,楊安鋼、【關鍵詞】遲緩愛德華菌;,抗獨特型抗體;,基因克隆;,序列分析 [摘要]目的:克隆并分析遲緩愛德華菌抗獨特型單克隆抗體（mAb）VH基因。方法:從分泌遲緩愛德華菌抗獨特型mAb的雜交瘤細胞株（1E11）中提取總RNA,利用RTPCR技術,擴增遲緩愛德華菌抗獨特型抗體VH基因,并將其克隆到PBSTvector中進行序列分析。結果:VH基因的全長序列為339bp,編碼113個氨基酸。通過NCBI/BLAST/N和IMGT數(shù)據庫（Lefrance,2001）分析表
2、明,VH基因符合小鼠IgGV區(qū)基因的特征:含有4個框架區(qū)（FR）,3個抗原互補決定區(qū)（CDR）及兩個抗體特征性的半胱氨酸。結論:成功地克隆了遲緩愛德華菌抗獨特型mAbVH基因,為進一步構建遲緩愛德華菌抗獨特型抗體基因工程疫苗奠定了基礎?！ 關鍵詞]遲緩愛德華菌;抗獨特型抗體;基因克隆;序列分析 遲緩愛德華菌(EdAb）工程疫苗,且已商品化生產。由于滅活疫苗的抗原性較弱,而減毒疫苗的安全性不穩(wěn)定,為此,研制使用方便、高效、易商品化大規(guī)模生產、切實有效的疫苗,對水產業(yè)甚為必要。我們首次從分泌抗遲緩愛德華菌獨特型mAb的雜交瘤細胞株（1E11）中提取總RNA,并以
3、RTPCR成功克隆了該mAb的VH基因。 1材料和方法 1.1材料分泌抗遲緩愛德華菌獨特型mAb的雜交瘤細胞株（1E11）為本室建立[6]。RPMI1640干粉為GibcoBRL公司產品。RNA抽提試劑TRIzolTMReagents購自TaKaRa公司。RTPCR試劑盒為美國Invitrogen公司產品。質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒,均購自北京博大泰克公司。PCR試劑,連接試劑和pBSTvector均購自北京天為時代公司。 1.2方法遲緩愛德華菌抗獨特型mAbVH基因的擴增:復蘇分泌抗遲緩愛德華菌獨特型mAb的雜交瘤細胞株（1E11）,傳至3代使細胞數(shù)目
4、達2.8×107/L后收獲細胞。用TRIzolTMReagents、氯仿和異丙醇抽提RNA后,以無水乙醇沉淀。以11μLRNA為模板,以Oligo（dT）20為隨機引物,反轉錄合成cDNA第1鏈。PCR引物序列:Back:5′ATGAAATGCAGCTGGGGCAT(C,G)TTCTTC3′;For:5′CAGTGGATAGACAGATGGGGG3′。在25μL反應體系中,加入cDNA2μL,Back和For引物各1μL進行PCR。反應參數(shù)為:于94℃變性5min后,94℃、1min,50℃、1min,72℃、1min,共25次循環(huán)后,于72℃再延伸10min。
5、PCR產物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 2結果 2.1RTPCR擴增產物的鑒定經10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定表明,VH基因的RTPCR產物大小為420～500bp（圖1）。 圖1mAb1E11VH基因RTPCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析（略） 1:DL2000DNAmarker;2:VH基因的RTPCR產物. 2.2VH基因的克隆及序列分析將PCR擴增的VH基因膠回收后,克隆入pBSTvector載體中,并轉化E.coliDH5α的感受態(tài)細胞中,經Xgal藍白篩選后,挑取陽性克隆,經菌落PCR鑒定正確后進行測序。測序結果經IMGT數(shù)據庫（Lefran
6、ce,2001）分析顯示,VH基因具有小鼠IgGVH基因的特征,含有3個CDR區(qū),4個FR區(qū)和兩個抗體特征性的半胱氨酸(圖2)?！ D2抗遲緩愛德華菌獨特型mAbVH基因的核苷酸及推導的氨基酸序列（略） 3討論 克隆得到正確的抗體輕、重鏈可變區(qū)基因,是制備基因工程抗體中最重要也是最關鍵的一步。由于在RTPCR而得到的雜交瘤細胞株的cDNA中,一些非復制的重排片段是最佳的PCR模板;而且在進行細胞融合時可能融合不止一個脾細胞至骨髓瘤細胞,從而導致多種功能性以及非功能性V區(qū)基因發(fā)生。因此在做PCR克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基因時,可能會克隆出除目的基因以外無關的輕重
7、鏈基因。另外,由于V區(qū)基因內部的5′端和3′端的突變可能會抑制引物退火而阻礙擴增反應。因此我們采用了抗體重鏈可變區(qū)基因5′端的信號肽,及3′端恒定區(qū)的通用引物,通過NCBI/BLAST/N和IMGT數(shù)據庫（Lefrance,2001）將PCR出的基因序列進行分析,找出抗體重鏈可變區(qū)的基因序列,并在計算機上進行Blast綜合分析,經過以上研究工作的反復論證,以確?？贵w重鏈可變區(qū)基因的完整和準確。結果,通過Blast分析未見相同序列。我們得到的抗體重鏈可變區(qū)VH基因共編碼113個氨基酸,序列中無終止密碼子,為一開放讀框;具有4個FR,3個CDR和維持抗體V區(qū)空間結構
8、所必需的2個特征性的半胱
