遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單鏈抗體基因的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定

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1、遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單鏈抗體基因的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定作者：秦紅，金曉航，黃威權(quán)，劉玉林【摘要】目的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單鏈抗體基因。方法采用RTPCR方法從分泌遲緩愛德華菌獨(dú)特型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(1E11)中克隆出VH和VL可變區(qū)基因,再通過重疊延伸拼接PCR方法在VH和VL可變區(qū)基因之間引入連接肽(Gly4Ser)3，體外構(gòu)建單鏈抗體基因；將其克隆至表達(dá)載體pET28a并在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后，用SDSPAGE、Westernblot及ELASA進(jìn)行鑒定。結(jié)果遲緩愛德華菌抗獨(dú)

2、特型單鏈抗體基因scFv在BL21(DE3)菌中獲得表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物以不溶性包涵體形式存在，經(jīng)過溶解包涵體、純化和體外復(fù)性，獲得了高純度的單鏈抗體片段，重組蛋白的分子質(zhì)量為27ku。ELASA分析結(jié)果證實(shí)遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單鏈抗體基因scFv與原代抗體一樣，具有較高的抗原親和力。結(jié)論成功構(gòu)建了遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單鏈抗體基因scFv，為進(jìn)一步制備遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型抗體基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】遲緩愛德華菌；抗獨(dú)特型；單鏈抗體　　ABSTRACT:ObjectiveToconstruct,expressand

3、identifytheantiidiotypicantibodysinglechainvariablefragment12(scFv)againstEdwardsiellatarda.MethodsByusingRTPCRmethod,thevariableregionsoftheheavyandlightchainoftheantiidiotypicmonoclonalantibody(mAb)1E11againstEdwardsiellatardawereclonedandjoinedwitha(Gly4

4、Ser)3linker,andthescFvintheorientationofVLlinkerVHwasconstructed.ItwasthenclonedintovectorplasmidpET28a,expressedinEscherichiacoliBL21(DE3),andconfirmedbySDSPAGE,WesternblotandELISA.ResultsTherecombinantscFvcouldbeexpressedinE.coliBL21(DE3)inafusionprotein

5、pattern.Theexpressionproductwasintheformofaninclusionbodyandthepurifiedfusionproteinwasobtainedafterbeingpurifiedandrefolded.TheSDSPAGEandWesternblotanalysisshowedthatthemolecularweightofscFvproteinwas27ku.IndirectELISAconfirmedthatthescFvhadthebindingactivit

6、ytotheantigen.ConclusionTherecombinantantiidiotypescFvhasbeensuccessfullyconstructedandexpressedinE.coliBL21(DE3),providingthebasisandpotentialforpreparationofgeneticallyengineeredvaccineagainstEdwardsiellatarda.　　KEYWORDS:Edwardsiellatarda;antiidiotype;sing

7、lechainantibody12　　遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda)是腸桿菌科愛德華菌屬中唯一對人有致病性的細(xì)菌,并證實(shí)其為條件致病菌。該菌含有長度為5.3kb的溶血素基因，其表達(dá)產(chǎn)物為一種熱不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)，具有很強(qiáng)的致病性[1]。遲緩愛德華菌感染具有暴發(fā)性發(fā)作的特點(diǎn)，其原發(fā)感染或引起的繼發(fā)感染，對人或魚類的致病性均較嚴(yán)重[2]。目前，對該菌的治療仍然是使用各類抗生素，如在餌料中添加適量的土霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素、呋喃唑酮和磺胺類藥物等，但抗生素等易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留，對人類的健康帶來

8、危害?！　∶庖呔W(wǎng)絡(luò)學(xué)說認(rèn)為[3]，針對外來抗原的抗體分子(Ab1)可變區(qū)上獨(dú)特型(idiotype,Id)可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗Id抗體(Ab2)。其中Ab2β具有抗原“內(nèi)影像”的作用，可模擬抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對始動抗原的特異性抗體或細(xì)胞免疫應(yīng)答，并抑制Ab1與相應(yīng)抗原的結(jié)合反應(yīng)。針對Ab2β的這一特性，研制的抗獨(dú)特型抗體可代替抗原刺激機(jī)體，通過誘導(dǎo)機(jī)體的免