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《抗豬脂肪細(xì)胞膜單鏈抗體抗體庫(kù)的構(gòu)建及表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文抗豬脂肪細(xì)胞膜單鏈抗體抗體庫(kù)的構(gòu)建及表達(dá)姓名：丁淑燕申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：朱瑞良;苗向陽(yáng)20040520關(guān)于學(xué)位論文原創(chuàng)性和使用授權(quán)的聲明本人所呈交的學(xué)位論文，是在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行科學(xué)研究所取得的成果。對(duì)在論文研究期間給予指導(dǎo)、幫助和做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人或集體，均在文中明確說明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。本人完全了解山東農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留和使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留和按要求向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文紙質(zhì)本和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部
2、分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。論文作者簽名：丁漆茁、導(dǎo)師簽名：娑移串莎日期：2004．5．20山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文抗豬脂肪細(xì)胞膜單鏈抗體抗體庫(kù)的構(gòu)建及表達(dá)摘要為研究、大量制各高親和力抗豬脂肪細(xì)胞膜抗體，本實(shí)驗(yàn)從分子生物學(xué)和基因工程抗體技術(shù)的角度出發(fā)，首先構(gòu)建出抗豬脂肪細(xì)胞膜單鏈抗體，然后將單鏈抗體與噬菌體載體pCANTAB5E連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌TGl，構(gòu)建出抗豬脂肪細(xì)胞膜抗體庫(kù)，經(jīng)過淘選使得抗豬脂肪細(xì)胞膜抗體得以富集。ELISA檢測(cè)
3、鑒定富集效果，選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定。挑取陽(yáng)性克隆在大腸桿菌岫2151中表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。本研究做了以下幾方面的內(nèi)容：1構(gòu)建抗豬脂肪細(xì)胞膜抗體庫(kù)在本實(shí)驗(yàn)室其他人員所構(gòu)建的抗豬脂肪細(xì)胞膜單鏈抗體(Smg：echainIv,ScFv)的基礎(chǔ)上，用SfiI和NotI將ScFv的兩端酶切，克隆入同樣用SftI和NotI酶切的噬菌體載體pCANTAB5E，CaCl2轉(zhuǎn)化法將連接好的載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌TGl，構(gòu)建抗豬脂肪細(xì)胞膜噬菌體抗體庫(kù)。2對(duì)所構(gòu)建的抗體庫(kù)進(jìn)行篩選抗體庫(kù)經(jīng)輔助噬菌體援救后，用特異性抗原脂肪細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行篩選，每輪篩選
4、過后取噬菌體抗體庫(kù)少量感染的E．ColiTGl，涂板培養(yǎng)計(jì)算抗體滴度。篩選4輪使抗豬脂肪細(xì)胞膜抗體得以富集。制備重組噬菌體抗體，用ELISA檢測(cè)。3篩選出的抗體庫(kù)陽(yáng)性克隆在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)4輪篩選過后的抗體庫(kù)在SOBAG培養(yǎng)后挑取單菌落制備重組噬菌體，ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。產(chǎn)生的抗體的陽(yáng)性克隆用大腸桿菌HB2151在IPTG的誘導(dǎo)下進(jìn)行抗豬脂肪細(xì)胞膜單鏈抗體抗體庫(kù)的構(gòu)建及表達(dá)表達(dá)，提取出E．ColiHB2151周質(zhì)腔的表達(dá)產(chǎn)物，分別用ELISA和SDS—PAGE檢測(cè)。通過實(shí)驗(yàn)，我們成功地將單鏈抗體與噬菌體載體pCANTAB5E連接，并
5、轉(zhuǎn)染于大腸桿菌TGl，構(gòu)建出了抗豬脂肪細(xì)胞膜單鏈抗體抗體庫(kù)，對(duì)所構(gòu)建的抗體庫(kù)進(jìn)行4輪篩選過后，抗體得到明顯富集，最終獲得庫(kù)容量為6．7×107pfu／ml的中等庫(kù)容的抗體庫(kù)。將抗體庫(kù)中鑒定為陽(yáng)性的克隆表達(dá)于大腸桿菌I-'1132151，提取周質(zhì)腔產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，ELISA和SDS—PAGE檢測(cè)結(jié)果表明：我們所構(gòu)建的抗豬脂肪細(xì)胞膜抗體庫(kù)中的抗體可以在大腸桿菌中表達(dá)，但是表達(dá)量有限。關(guān)鍵詞：豬，脂肪細(xì)胞膜，單鏈抗體，噬菌體展示技術(shù)，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)2坐查查些查堂堡主堂魚笙蘭一——ConstructionandExpressionofScFvA
6、ntibodyLibraryagainstPorcineAdipocytePlasmaMembraneAbstractInthisresearch，wesUmr'tonthebaseofmolecularbiologyandgeneengineeringantibodytechnologyinordertoinvestigateandlargelyproducellighaffinityantibodyagainstporcineadipocyteplasmamembrane(APM)．SinglechainFv(ScFv)agains
7、tporcineAPMisconstructed．TheScFvgeneisclonedintophagemidvectorpCANTAB5EandE．coliTGIcompetentcellsRretransformed．TheclonesselectedonSOBAGplatesaresuperinfectedbyM13K07helperphage．Theanti-porcineadipocyteScFvphagelibrarywasestablished．ARer4timesscreeningwecanmaketheantibod
8、ygetenrichment,detectitwithELISAtoidentifytheeffectofenrichment，takethepositiveclonestodigestbyenzymean
