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《抗Ⅰ型鴨肝炎病毒RdRp蛋白噬菌體單鏈抗體庫(kù)構(gòu)建及單鏈抗體的淘選.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、第37卷第5期中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)VO1．37．No．52015年5月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineMay．2015doi：10．3969~．issn．1008-0589．2015．05．03抗I型鴨肝炎病毒RdRp蛋白噬茵體單鏈抗體庫(kù)構(gòu)建及單鏈抗體的淘選王永娟，一，李碧春，沈明君，洪偉鳴，左偉勇’(1．揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2．江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州225300)摘要：為構(gòu)建抗1型鴨肝炎病毒(DH
2、V．1)RdRp蛋白的單鏈抗體(scFv)庫(kù)，并淘選特異性scFv，本研究采用RT．PCR方法從DHV．1基因組中擴(kuò)增RdRp基因，將其克隆于pET．32a載體中進(jìn)行重組RdRp蛋白原核表達(dá)。將純化的重組蛋白免疫小鼠，以提取的免疫鼠脾臟總RNA為模板，利用抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)簡(jiǎn)并引物，經(jīng)RT．PCR擴(kuò)增抗體的VL和VH編碼序列，由Linker序列連接，通過(guò)重疊延伸PCR(SOE．PCR1擴(kuò)增完整的scFv基因(VI_-Linker-V．)。將擴(kuò)增的seFv基因克隆于pCANTAB5E載體中構(gòu)建噬菌體sc
3、Fv文庫(kù)，利用純化的重組RdRp蛋白開(kāi)展4輪吸附．洗脫．富集以淘選抗RdRp的ScFv；最后對(duì)淘選到的陽(yáng)性ScFv進(jìn)行可溶性表達(dá)，以ELISA方法檢測(cè)其免疫結(jié)合活性。結(jié)果顯示，獲得了7株具有良好抗原結(jié)合活性的ScFv。淘選到的DHV．1RdRp特異的基因工程ScFv，為鴨病毒性肝炎防制新策略研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：1型鴨肝炎病毒；RdRp；噬菌體抗體庫(kù)；單鏈抗體中圖分類號(hào)：$852．65文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008．0589(2015)05．0334．05ConstructionoOftphagesingle．一chai
4、nantibody(scFl-v)1IibraryforRdRPproteinofduckhepatitisvirustype1andthespecificscFvpanningwANGYong-juan，一，LIBi-chun，SHENMing-jun，HONGWei—ming2，ZUOWei—yonf(1CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2．JiangsuProvincialKeyLaboratoryof
5、VeterinaryBio-pharmaceuticalHighTechResearch，JiangsuAgri—animalHusbandryVocationalCollege，Taizhou225300，China)Abstract：Toconstructphagedisplaymurinesingle—chainantibodyvariablefragment(scFv)libraryforRdRpproteinofduckhepatitisvirustype1(DHV一1)andscreenthespecificsc
6、FvagainstRdRp，theRdRpgenewasamplifiedfromthegenomicRNAofDHV-1byRT—PCRmethodandclonedintopET一32avectorforexpressioninE．coil．Then，micewereimmunizedwiththeexpressedrecombinantRdRp，andtotalRNAwasextractedfromthespleenofimmunizedmicetoamplifythevariableregionsencodingse
7、quencesoftheheavy(VH)andlightchains(V0withdegenerateprimersbyRT—PCR．Inaddition，thecompletesequenceofscFvwasamplifiedwithalinkersequencebySOE—PCR．Furthermore，scFvsequenceswereclonedintopCANTAB5EvectortoconstructthescFvphagedisplaylibrary．Eventually，usingpurifiedreco
8、mbinantproteinRdRpaspanningantigen，sevenScFvswiththebindingafinitytoRdRpwereidentifiedafter4roundsofprocedurebinding-elution—enrichmentbyELISA．In
