人源單鏈抗體噬菌體展示文庫的構(gòu)建及抗LOX-1單鏈抗體的篩選

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1、人源單鏈抗體噬菌體展示文庫的構(gòu)建及抗Ｌ０Ｘ－１單鏈抗體的篩選Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｈｕｍａｎｈａｅｄｉｓｌａｌｉｂｒａｒａｎｄｐｇｐｙｙ－ｓｃｒｅｅｎ－ｖｉｎｇａｎｔｉＬＯＸ１ｓｃＦ作者姓名：孟兆麗專業(yè)名稱：生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向：蛋白質(zhì)工程基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研宄指導(dǎo)教師：謝秋宏教授學(xué)位類別：理學(xué)博士培養(yǎng)單位：生命科學(xué)學(xué)院論文答辯日期：２０１４年１２月４日授予學(xué)位日期：２０１４年１２月４日答辯委員會主席：胡耀輝教授論文評閱人：胡耀輝教授李青山教授池振明教授未經(jīng)本論

2、文作者的書面授權(quán)，依法收存和保管本論文書面版本、電子版本的任何單位和個人，均不得對本論文的全部或部分內(nèi)容進(jìn)行任何形式的復(fù)制、修改、發(fā)行、出租、改編等有礙作者著作權(quán)的商業(yè)性使用（但純學(xué)術(shù)性使用不在此限）。否則，應(yīng)承擔(dān)侵權(quán)的法律責(zé)任。吉林大學(xué)博士學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交學(xué)位論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行研宄工作所取得的成果。除文中己經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研宄做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法

3、律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：日期７：＞／今年月ｆ日中文摘要人源單鏈抗體睡菌體展示文庫的構(gòu)建及抗ＬＯＸ－１單鏈抗體的篩選－ｘ凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體１ｌｅｃｔｉｎｌｉｋｅｏｉｄｉｚｅｄｌｏｗｄｅｎｓｉｔｌｉｏｒｏｔｅｉｎ（ｙｐｐｒｅｃｅｔｏｒ－－ｏｘｎｓ１ＬＯＸ１是氧化低密度脂蛋白（ｉｄｉｚｅｄｌｏｗｄｅｉｔｌｉｏｒｏｔｅｉｎ，ｏｘＬＤＬｐ，）ｙｐｐ）的主要受體ｋ－，分子量約為５０Ｄａ的ＩＩ型膜蛋白，屬于Ｃ型凝集素家族。ＬＯＸ１－－ｅｘａｌｕｒ胞外結(jié)構(gòu)域（ＬＯＸ１ｔｒｃｅｌｌａｄｏｍａｉ

4、ｎＬＯＸ１ＥＣＤ）被蛋白酶水解并釋放到血，ＬＯＸ－－－－液中形成可溶性１（ｓｏｌｕｂｌｅＬＯＸ１，ｓＬＯＸ１）。ＬＯＸ１是動脈粥樣硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃ－ｌｅｒｏｓｉｓＡｓ）及Ａｓ相關(guān)疾病的新型潛在藥物耙點。此夕卜，通過ＬＯＸ１，－的靶向成像可實現(xiàn)動脈硬化斑塊的定位和危險分層。因此，以ＬＯＸ１為靶點的抗體研發(fā)對于動脈硬化治療具有重要意義。尤其是人源抗體在臨床診斷和治療中目前所報道的ＬＯＸ－更加安全、有效，是抗體研宄的熱點。然而１抗，體多為動物。來源，人源抗體的研究報道極少噬菌體展示技術(shù)避免了雜交瘤技術(shù)所必需的動物免疫過

5、程，是體外獲得人源抗體的重要手段。它的最大優(yōu)勢是可直接將抗體片段展示于噬菌體表面并與內(nèi)部包裹的基因信息建立物理連接，便于操作。不同于完整免疫球蛋白分子，單鏈抗體（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）是由重鏈可變區(qū)ＶＨ和輕鏈可變區(qū)ＶＬ經(jīng)ｇ一工程小分子抗體由段氨基酸肽段（Ｌｉｎｋｅｒ）連接而成的基因。ｓｃＦｖ分子量小，免疫原性小，且在組織和腫瘤的滲透性強(qiáng)，在動脈硬化斑塊的成像、治療上具有ｘ８－相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢。本文為獲得抗ＬＯＸ１全人源ｓｃＦｖ了庫容量為６．２ｌ〇的人源，構(gòu)建＂６一ＸｓｃＦｖ噬菌體展示文

6、庫株親和常數(shù)為５．８１０Ｍ的單鏈抗，并從中篩選獲得了－ｓｃＦｖ－３９體，本研究為以ＬＯＸ１人源抗體為核心的治療動脈粥樣硬化藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。首先－Ｄ蛋白的，本研宄采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功地實現(xiàn)了ＬＯＸ１ＥＣ大量可溶性表達(dá)并采用ＭＢＰ親和層析和分子篩純化方法獲得了純化的ＬＯＸ－１，ＥＣＤ。通過對宿主細(xì)胞和促溶標(biāo)簽的系統(tǒng)性優(yōu)化，結(jié)果表明在宿主細(xì)胞Ｒｏｓｅｔａａ－ｍｉ２ＤＥ３中ＬＯＸ１ＥＣＤ與ＭＢＰ標(biāo)簽融合表達(dá)時，融合蛋白的可溶性表達(dá)ｇ（），Ｉ°－－產(chǎn)量最高。通過表達(dá)條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，ＭＢＰＬＯＸ１ＥＣＤ融合蛋

7、白在３０Ｃ條件ＩＰＴＧ誘導(dǎo)可溶性表達(dá)產(chǎn)量最高。本文通過ＭＢＰ下培養(yǎng)，采用２００ｐＭ的，蛋白的－－親和層析和分子篩的純化，獲得了純化的融合蛋白ＭＢＰＬＯＸ１ＥＣＤ。采用濃度－為２．５Ｕ／ｍ血酶作用于ＭＢＰ和ＬＯＸ１ＥＣＤ蛋白之間的氨基酸識別位點ｇ的凝，有效地去除融合蛋白中的ＭＢＰ標(biāo)簽。再通過ＭＢＰ親和層析和分子篩結(jié)合的純９５％－ＥＣＤ化方法獲得了純度為的ＬＯＸ１蛋白，并具有較高的ｏｘＬＤＬ結(jié)合活性。一ｓｘ其次．２１０，采用分子生物學(xué)和基因工程的方法構(gòu)建了個容量為６人源ｓｃＦｖ嗤菌體展示文庫。本文分離２０名心血管病人ＰＢ

8、ＭＣＰｅｒｉｐｈｅｒａＩＷｏｏｄ（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ，ＰＢ