抗速滅威噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建、篩選及鑒定.pdf

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1、第5O卷第9期湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)Vo1．50No．92011年5月HubeiAgricuhuralSciencesMav．．2011抗速滅威噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建、篩選及鑒定李鐵軍．李德全(1．南通職業(yè)大學(xué)化工與生物工程學(xué)院，江蘇南通226007；2．南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南通226007)摘要：以速滅威抗原免疫的小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，取其脾細(xì)胞，RT—PCR擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因。重疊延伸PCR拼接單鏈抗體(ScFv)基因，克隆入噬菌粒表達(dá)載體pCANTAB5E并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1．成功構(gòu)建了庫(kù)容約7．6xlO5的抗速滅威噬茵體ScFv庫(kù)對(duì)該文

2、庫(kù)進(jìn)行了5輪“吸附一洗脫一擴(kuò)增”的富集篩選．獲得了6個(gè)特異性較強(qiáng)的抗速滅威噬茵體ScFv陽(yáng)性克隆其研究結(jié)果為速滅威特異性抗體的大量制備奠定了一定的基礎(chǔ)關(guān)鍵詞：速滅威：?jiǎn)捂溈贵w：噬茵體展示中圖分類號(hào)：Q819文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439—8114(2011)09—1908—05Construction，ScreeningandIdentificationofPhageScFvLibraryAgainstMetolcarbLITie-jan，LIDe-quan2(1．ChemicalandBiologicalEngineeringInstitute，NantongV

3、ocationalCollege，Nantong226007，Jiangsu，China2．CollegeofLifeScience，LifeandScienceCollegeofNantongUniversity，Nantong226007，Jiangsu，China)Abstract：Balb／CmicewereimmunizedwithahaptenconjugateofMetolcarb，andtheirspleencellswereharvested．VHandVLgeneswereamplifiedbyRT-PCR．VHandvLwerematchedi

4、ntoscF￡byovedapextensionPCR．a(chǎn)ndclonedintopCANTAB5Eexpressionvector，andthentransformedTG1cells．Thusthephagesingle—chainFv(ScFv)librarywithasizeofabout7．6x10wassuccessfullyconstructed．Thelibrarywasbiopannedby5roundsofbinding—elution—enrichmentprocedure：and6positivecloneswithhighspecifici

5、tyforMetolcarbwereobtained．Theresuhsgeneratedcouldbethefoundationforlarge—scaleproductionofspecificantibodiesagainstMetolcarb．Keywords：metolcarb；singlechainFv(ScFv)；phage—display速滅威(Metolcarb．3一甲苯基一Ⅳ一甲基氨基甲酸直是制約免疫分析法在農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域應(yīng)用的酯)是氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑．具有觸殺和熏蒸作用．瓶頸因素。與傳統(tǒng)的多抗和單抗制備技術(shù)相比．第主要用于稻田、蔬菜、水果及經(jīng)

6、濟(jì)作物等的害蟲(chóng)防三代抗體制備技術(shù)——噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)具有基治雖然速滅威為中等毒殺蟲(chóng)劑．但農(nóng)產(chǎn)品上殘留因型與表型相統(tǒng)一、選擇與擴(kuò)增相統(tǒng)一的優(yōu)點(diǎn)，它的速滅威仍會(huì)對(duì)人體健康造成潛在的危害．有必要不僅可以繞過(guò)繁瑣的雜交瘤制備過(guò)程．甚至可以省對(duì)其進(jìn)行持續(xù)的監(jiān)控檢測(cè)?略動(dòng)物免疫的步驟．使得建立各種文庫(kù)以及體外篩目前定量分析速滅威殘留的主要方法是氣相選任何目的分子的重組抗體成為可能。因此，噬菌色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC)等儀器分析法，體抗體庫(kù)技術(shù)為化學(xué)農(nóng)藥抗體的制備開(kāi)拓了新的但這些方法必須對(duì)樣品進(jìn)行步驟冗長(zhǎng)的純化處理．思路。很難達(dá)到快速、簡(jiǎn)便的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求；與儀器分析本

7、研究利用噬菌體展示技術(shù)．構(gòu)建抗速滅威噬相比，免疫分析法具有快速、簡(jiǎn)單、靈敏、價(jià)廉等優(yōu)菌體ScFv庫(kù)．從中篩選與速滅威特異性結(jié)合的噬菌點(diǎn)．可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景和體ScFv陽(yáng)性克隆．為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)速滅威免疫快速檢開(kāi)發(fā)潛力[測(cè)提供大量制備特異性抗體的新途徑。目前，國(guó)內(nèi)抗體作為免疫分析的核心試劑．其制備技術(shù)一外有關(guān)速滅威ScFv制備的研究尚未見(jiàn)報(bào)道收稿日期：2010—07—3l作者簡(jiǎn)介：李鐵軍(1972一)，男，江蘇南通人，講師，博士，主要從事基因工程抗體和農(nóng)藥殘留免疫分析技術(shù)研究，(電話)15996542736(電子信箱)relefa@126．con。