全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選鑒定

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1、ResearchPapers研究報(bào)告生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展ProgressinBiochemistryandBiophysics2008,35(8):947~953www.pibb.ac.cn全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選鑒定*肖艷李官成**李躍輝黃建童永清張志杰(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，長(zhǎng)沙410078)摘要體外致敏并用EBV轉(zhuǎn)化肝癌患者的PBMC.用PCR分別擴(kuò)增VH和VL基因并組成ScFv基因.將ScFv基因與載體fuse5連接后，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061，構(gòu)建噬菌體呈現(xiàn)型ScFv庫(kù).用人肝癌細(xì)胞及人肝細(xì)胞對(duì)初級(jí)噬菌體

2、抗體庫(kù)進(jìn)行親和富集及phage-ELISA篩選.篩選獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行ELISA及免疫組化鑒定并測(cè)序.結(jié)果表明，經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的4例肝癌患者PBMC，ELISA檢測(cè)均有抗肝癌抗體產(chǎn)生，經(jīng)多次PCR，擴(kuò)增出6種VH(γ、μ)和9種VL(κ、λ)基因，經(jīng)連接組成54種ScFv基因.將ScFv基因與載體連接后，導(dǎo)入大腸桿菌MC1061，得到庫(kù)容為1.0×108的初級(jí)噬菌體抗體庫(kù)，全長(zhǎng)ScFv基因的插入率為80%.用人肝癌細(xì)胞系HepG2和人肝細(xì)胞系QSG-7701對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行三輪正負(fù)淘選和富集后，從中隨機(jī)挑取533個(gè)克隆進(jìn)行ELISA篩選，得到179個(gè)

3、陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性率為33.6%.將179個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)一步進(jìn)行其他細(xì)胞系的鑒定，發(fā)現(xiàn)克隆A82對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2、人胚腎上皮細(xì)胞系HEK293呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示與人肝細(xì)胞癌組織有特異性反應(yīng)，而不與正常肝組織反應(yīng).且A82的相對(duì)親和力為2.4mol/L，解離常數(shù)K為5.32×10-9mol/L，顯示其親和力d較高.對(duì)克隆A82進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明：A82全長(zhǎng)742bp，含linkercDNA序列45bp，重鏈可變區(qū)基因與人胚系IgVH3-23有94.3%的同源性，輕鏈可變區(qū)基因與人胚系IgV4-2有94.9%的同源性，V-D-J

4、分別屬于VH3-23-D2-21-JH6-linker-V4-2-JL2.由上述結(jié)果可見，應(yīng)用體外抗原致敏方法和EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)聯(lián)合噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，構(gòu)建了庫(kù)容量達(dá)1×108的全人源抗肝癌單鏈抗體庫(kù)，通過細(xì)胞ELISA和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，獲得的噬菌體抗體克隆A82具有較強(qiáng)的特異性，為肝癌的臨床診斷及導(dǎo)向治療奠定了基礎(chǔ).關(guān)鍵詞EB病毒轉(zhuǎn)化，噬菌體抗體庫(kù)，肝癌，單鏈抗體學(xué)科分類號(hào)R739.63肝癌是一種惡性程度極高的腫瘤，其治療仍以手術(shù)切除為首選，但復(fù)發(fā)率極高，加上肝癌早期多1材料和方法無臨床癥狀，絕大部分發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于中晚期，喪失1.1材料了手術(shù)時(shí)機(jī)

5、，化療藥物應(yīng)用于人體又會(huì)導(dǎo)致很大的絲狀噬菌體FUSE5，K802、MC1061大腸肝副作用.單克隆抗體以其特異靶向性在臨床放射免菌菌株均由本室保存.絨猴淋巴母細(xì)胞系B95.8，疫診斷和導(dǎo)向治療方面有較大的應(yīng)用價(jià)值[1,2]，但肝癌細(xì)胞株HepG2，鼻咽癌細(xì)胞系CNE2，大腸癌也存在諸多缺陷，制約了其在臨床的應(yīng)用.ScFv細(xì)胞系HRT-18，宮頸癌細(xì)胞系Caski，肺癌細(xì)胞彌補(bǔ)了傳統(tǒng)單克隆抗體(mAb)制備繁瑣、抗原性系A(chǔ)549，及人類正常細(xì)胞肝細(xì)胞系QSG-7701，人強(qiáng)、穿透力弱等不足，可望成為肝癌放射免疫診斷胚腎上皮細(xì)胞系HEK293，骨髓

6、間質(zhì)干細(xì)胞和導(dǎo)向治療的有力工具.本研究擬解決鼠源性單抗HBMSC，原代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC等用于導(dǎo)向治療穿透力低及易產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)等難題，采用體外致敏法和EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)聯(lián)合噬菌*湖南省衛(wèi)生廳科研基金重點(diǎn)項(xiàng)目(A2003001).體展示技術(shù)構(gòu)建全人源的抗肝癌ScFv庫(kù)，并進(jìn)一**通訊聯(lián)系人.步篩選獲得高親和力的抗肝癌ScFv，為肝癌的臨Tel:0731-4805445,Email:libsun@public.cs.hn.cn床診斷及導(dǎo)向治療奠定基礎(chǔ).收稿日期：2008-03-29，接受日期：2008-05-29·948·生物化學(xué)與生

7、物物理進(jìn)展Prog.Biochem.Biophys.2008;35(8)均由本室保存.胎牛血清(FCS)及小牛血清(NBS)為1.2.5VH和VL基因的PCR擴(kuò)增與連接.按文獻(xiàn)杭州四季青公司產(chǎn)品.rhIL-2、谷氨酰胺、丙酮酸[3]設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增人抗體基因的引物.以cDNA第鈉及環(huán)孢菌素A均為Sigma公司產(chǎn)品.一鏈為模板，在TaqDNA酶作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)RPMI1640、瓊脂糖和細(xì)菌培養(yǎng)基，均購(gòu)自Gibco/增VH和VL基因.并通過編碼連接肽(Gly4Ser)3使BRL公司.TRIzol為Invitrogen公司產(chǎn)品.cDNAVH和VL基因

8、連成ScFv基因.回收PCR產(chǎn)物并合成試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品.PCR產(chǎn)物純化測(cè)定其濃度.試劑盒，小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技1.2