鈉泵抑制物噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建論文

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1、鈉泵抑制物噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建論文.freelin）免疫小鼠，取脾臟，分離淋巴細胞，提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，用簡并引物經(jīng)PCR分別擴增輕、重鏈抗體庫，經(jīng)重疊延伸PCR由Linker將輕、重鏈拼接成ScFv（單鏈抗體），用RS引物以ScFv為模板進行第2次PCR.freelentvariable）antibodylibrarybyphagedisplay.METHODSMicemunizedbyOUA-OVA（ouabain-ovalbumin）.mRNAthespleenlymphocyteandreverselytranscripted.Theheavy-chainandk

2、appalight-chainvariableregiongenes（VHandVL）repertoirsofim-munoglobinplifiedindividuallyandassembledintoScFvbyalinkerplifieder，meantimeSfiIandNotIrestric-tionsitesidpCANTAB5EandintroducedintoE.coliTG1byelectropo-ration.Phagemid-containingbacterialcoloniesmunizedentbly，theScFventafterEcoRIandHindⅢdig

3、estion.Trans-fectiontestindicatedthatthetiteroftheculturesupernatantAb的鼠源性而大大限制了其在臨床上應(yīng)用，由此相繼出現(xiàn)了基因工程抗體和噬菌體抗體庫技術(shù).我們通過噬菌體展示技術(shù)制備鈉泵抑制物（又稱內(nèi)源性哇巴因，endogenousouabain，EO）單鏈抗體庫，以期從中篩選到鈉泵抑制物單鏈抗體.1材料和方法1.1材料RNA及mRNA提取試劑盒分別為美國Gibco公司及美國Bio101公司產(chǎn)品.逆轉(zhuǎn)錄酶為Pharmacia公司產(chǎn)品.TaqDNA聚合酶為美國Promega公司產(chǎn)品;dNTP為Clontech公司產(chǎn)品.PCR引物

4、為Pharmacia公司產(chǎn)品，其中①Heavy-chainprimer1和2分別為VH基因5’端和3’端引物，用來擴增鼠IgVH基因;②Light-chainprimermix為10種VL基因引物的混合物，用來擴增鼠IgVL基因;③Linkerprimermix:序列為（Gly4Ser）3，該引物兩端的各24個堿基分別與VH和VL基因的3’端和5’端相互補，從而可將VH和VL基因片段拼接成ScFv基因;④RSprimermix為帶有SfiI位點的重鏈基因5’端引物和帶有NotI位點的輕鏈基因3’端引物的混合物，用來擴增ScFv基因片段同時引入克隆位點.噬菌粒載體pCANTAB5E為Pharm

5、acia公司產(chǎn)品.其中含有氨芐抗性基因（Ampr），Plac啟動子及M13噬菌體間隔區(qū)片段，用于克隆ScFv基因的SfiI，NotI克隆位點及Etag序列和瑚珀終止碼TAG;⑤輔助噬菌體M13KO7為Pharmacia公司產(chǎn)品，帶有突變型基因Ⅱ，質(zhì)粒復(fù)制起點和卡那霉素抗性基因（Kanr），在其輔助下可使前者產(chǎn)生含單鏈噬菌粒基因組的噬菌體顆粒.細菌菌株TG1為Pharmacia公司產(chǎn)品，用于ScFv噬菌體表面展示.1.2方法［1-5］6in）免疫小鼠，每隔4RNA.參照Pharmacia公司的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)產(chǎn)品說明書，以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下37℃1h合成cDNA第1條鏈.以逆轉(zhuǎn)錄合成

6、的cDNA第1條鏈為模板，用通用引物進行全套VH和VL基因的擴增.純化回收的VH，VL基因片段與Linkerprimermix以相同或接近等摩爾濃度混合進行重疊延伸PCR反應(yīng)，從而將全套VH，VL基因隨機拼接成ScFv基因庫.以RSprimer為引物將拼接的ScFv擴增，同時在5’及3’端分別加上SfiI，NotI酶切位點.用SfiI和NotI消化ScFv，將全套ScFv基因片段與pCANTAB5E載體在T4DNA連接酶（5～7）U作用下進行連接.同時作載體自連和陽性插入（controlinsert）對照.用BioRad電轉(zhuǎn)化儀將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TG1感受態(tài)細胞，37℃搖床1h后，取100μL

7、涂于SOBAG（含有100mgL-1氨芐青霉素和20gL-1葡萄糖的SOB培養(yǎng)基）瓊脂板上，30℃培養(yǎng)24h.從生長良好的SOBAG平皿上挑取12個單菌落提取質(zhì)粒用EcoRⅠ和HindⅢ進行酶切鑒定.取部分菌液加氨芐青霉素至終濃度為100mgL-1和葡萄糖至終濃度為20gL-1，37℃振蕩培養(yǎng)（250rmin-1）1h.至對數(shù)生長期后，加入M13KO7輔助噬菌體，37℃振蕩培養(yǎng)1h.離心，棄上清后將沉淀細胞再