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《抗 ICOSL 核糖體展示單鏈抗體庫的構(gòu)建.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，JournalofAnhuiAsh．Sci．2013，41(33)：12819—12822責(zé)任編輯石金友責(zé)任校對李巖抗ICOSL核糖體展示單鏈抗體庫的構(gòu)建嚴(yán)浩，王芳，毛偉平，王文倩，孟素芳，邵巒巒，劉小精(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇南京210046)摘要[目的]構(gòu)建出鼠源抗ICOSL核糖體展示抗體庫。[方法]通過RT—PCR從人B淋巴瘤細(xì)胞Daudi的總RNA中擴(kuò)增出ICOSL胞外區(qū)基因，并將此基因插入到原核表達(dá)載體pET28a中進(jìn)行表達(dá)。以表達(dá)純化的ICOSL蛋白為抗原免疫Balb／e小鼠，取小鼠脾臟提
2、取總RNA，通過RT—PCR擴(kuò)增小鼠的重鏈可變區(qū)和Linker(VH—linker)序列，以及輕鏈可變區(qū)和Linker(VK—linker)序列。經(jīng)重組PCR將兩段基因連接起來，將VH／K與pMD19一T栽體鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E．coliDH5d，PCR鑒定并測序。[結(jié)果]VH和K鏈得到正確的擴(kuò)增，長度分別為421和689bp，VH／K連接產(chǎn)物正確，連接產(chǎn)物長度為1079bp。[結(jié)論]所采用的引物及反應(yīng)條件能夠擴(kuò)增出目的基因，成功構(gòu)建了鼠源抗ICOSL核糖體展示抗體庫，為進(jìn)行核糖體展示體外篩選抗ICOSL特異性單鏈抗體奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞ICOSL(可誘導(dǎo)共
3、刺激因子配體)；單鏈抗體；核糖體展示技術(shù)；原核表達(dá)中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號o517—6611(2013)33—12819—04ConstruetionofAnti．ICoSLRibosomeDisplayLibraryYANHaoetal(JiangsuProvinceKeyLaboratoryofMolecularandMedicalBiotechnology，CollegeofLifeSciences，NanjingNormalUni—versity，Nanjing．Jiangsu210046)Abstractl0biective
4、]Anti．ICOSLribosomedisplay1ibrarywasconstructed．IMethodlThecDNAofICOSLextracellulardomainwasampli—fledfromDaudicellbyRT．PCR．TheICOSLgenewasinsertedintoplasmidpET28atoexpress．RNAfromthespleensofBalb／cmicewhichhadbeenimmunizedwithICOSLproteinwereselected．HeavychainandKchaingenes
5、(VHandK)wereamplifiedseparatelybyreversetranscfiptasepolymerasechainreaction(RT—PCR)，andtheanti—ICOSLVH／KchainribosomedisplaylibrarywasconstructedbyassemblingVHandKwithaspecialflexiblelinkerbyoverlapextensionPCR(SOE—PCR)．TheVH／KchainwasligatedintopMD19一Tvectorandtheli—gatedsam
6、plewastransformedintocompetentE．c0屁DH5Q．TheplasmidDNAwasidentifiedwithPCRandsequenced．1Results]VHandKwereamplifiedeo=eeflyandthelengthwere421and689bprespectively．VH／Kwasligatedcorrectlyandthelengthwas1093bp．IConclu—sion1Theprimersandreactionconditionwereabletogeneraterequiredg
7、enes．VH／Kchainribosomedisplaylibrarywasconstructedcorrectly．ItwasthebasisforscreeningsinglechainantibodyspecificforICOSLbyribosomedisplaytechnique．KeywordsICOS：Sing．chainantibody；Ribosomedisplay；ProkaryoticexpressionT細(xì)胞的活化需要2種不同信號的刺激，第1信號來自(無3’端終止密碼子)在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與翻譯過程，在翻譯其表面受體與抗原肽一
8、MHC分子復(fù)合物的特異性結(jié)合，即T的最后階段，蛋白質(zhì)、核糖體與mRNA分子結(jié)合在一起，形成細(xì)胞對抗原識別；T細(xì)胞活化的第2
