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《鼠抗人ctni單克隆抗體fab段基因克隆和序列分析》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、鼠抗人cTnI單克隆抗體Fab段基因克隆和序列分析作者:李妍妍,楊笛,卞智萍,徐晉丹,陳相健,顧春榮,張寄南【摘要】目的:克隆鼠抗人cTnImAbFab段基因并進(jìn)行序列分析.方法:設(shè)計(jì)擴(kuò)增鼠IgG重鏈Fd段及κ輕鏈引物,從分泌cTnImAb的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA,RTPCR擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分子克隆、測(cè)序及序列分析.結(jié)果:重鏈和輕鏈引物分別擴(kuò)增出一約700bp和800bpDNA片段.經(jīng)序列分析,與已發(fā)表的鼠IgG基因序列對(duì)比,其核苷酸及其所推導(dǎo)的氨基酸序列符合鼠IgG1Fab段特征.在GenBank登錄,登錄號(hào)為
2、AY484430(重鏈),AY484431(輕鏈);氨基酸序列登錄號(hào)為AAR83243(重鏈),AAR83244(輕鏈).結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)室獲得了完整的鼠源性抗人cTnImAbFab段基因,為鼠抗人cTnI的人源化改造奠定了基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】抗體,單克隆;基因;序列分析;血清心肌鈣蛋白 【Abstract】AIM:ToobtainthegeneofmurineanticTnIFabfragmentandanalysethenucleotideanddeducedaminoacidsequences.METHODS:ByRT
3、PCRmethod,thecDNAofanticTnImurineantibodyFabfragmentplifiedfromthehybridomacells.CloningandsubsequentsequenceanalysisoftheFabfragmented.Thededucedaminoacidsequenceate700and800basepairsplifiedusingIgGheavychainprimersandκlightchainprimers,respectively.Sequencean
4、alysisindicatedthatthededucedaminoacidsequencesinoacidpresentinthemurineIgG1Fabfragment(GenBankaccessionNOAY484430,AY484431;ProtEinBankaccessionNOAAR83243,AAR83244).CONCLUSION:ThecloningandsequencingofapletemurineanticTnIFabfragmentprovidesabasisfortheproduction
5、ofthechimericanticTnIantibody. 【Keyonocolonal;genes;sequenceanalysis;cardiactroponinI 0引言 本室已有多株高特異高表達(dá)的鼠源性抗人cTnI細(xì)胞株,用來(lái)檢測(cè)心肌損傷時(shí)外周血中cTnI水平高低,顯示了較高的臨床診斷價(jià)值[1-4].但由于鼠源性mAb的人抗鼠抗體反應(yīng)[5],使之不能用于體內(nèi)診斷及作為治療心肌損傷的藥物載體,所以必須對(duì)其進(jìn)行人源化修飾,有關(guān)鼠源性抗人cTnI的人源化改造少見(jiàn)報(bào)道.本研究目的是將鼠源性抗cTnI抗體Fab段
6、基因克隆出來(lái)并進(jìn)行序列分析,為下一步制備嵌合抗體打下基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料雜交瘤細(xì)胞株1株(JS200202),大腸桿菌E.coliDH5α由本室保存.pMD18T載體購(gòu)自TaKaRa公司.TaqDNA聚合酶,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司);IPTG(異丙基βD半乳糖苷),XGal(5溴4氯3吲哚半乳糖苷)為上海生物工程公司產(chǎn)品.質(zhì)粒小量抽提試劑盒為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品,G03SL離心式高純質(zhì)粒大量抽提試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品. 1.2方法 1.2.1PCR引
7、物設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的小鼠Fab段的Fd基因和輕鏈基因、FR1和第一恒定區(qū)3′端的保守的基因序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增Fd基因和輕鏈基因的5′端和3′端引物.重鏈Fd段5′端引物:H1:5′SAKGTGCAGCTCGAGSAGTCAGGACCT3′;H2:5′GAGGTYCAGCTCGAACARTCTGGACCT3′;H3:5′CAGGTCCAACTCGAGCAGYCTGGGKCT3′;H4:5′GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGRGCAGCTCGAGGAGTCTGGGGGA3′;輕鏈基因的5′端引物1:5′
8、CCTCTAGAGACATCCAGATGAMCCAGTCTCC3′;2:5′CCTCTAGAGACATYKTGCTGACYCARTCTCC3′;3:5′CCTCTAGARACATTGTRATGACMCARTCTCC3′;4:5′CCTCTAGAGACATYCAGMTGACYCAGTCTCC3′;5:5