鼠抗人ctni單克隆抗體fab段基因克隆和序列分析

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1、鼠抗人cTnI單克隆抗體Fab段基因克隆和序列分析作者：李妍妍，楊笛，卞智萍，徐晉丹，陳相健，顧春榮，張寄南【摘要】目的：克隆鼠抗人cTnImAbFab段基因并進(jìn)行序列分析.方法：設(shè)計(jì)擴(kuò)增鼠IgG重鏈Fd段及κ輕鏈引物，從分泌cTnImAb的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，RTPCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分子克隆、測(cè)序及序列分析.結(jié)果：重鏈和輕鏈引物分別擴(kuò)增出一約700bp和800bpDNA片段.經(jīng)序列分析，與已發(fā)表的鼠IgG基因序列對(duì)比，其核苷酸及其所推導(dǎo)的氨基酸序列符合鼠IgG1Fab段特征.在GenBank登錄，登錄號(hào)為

2、AY484430（重鏈）,AY484431（輕鏈）;氨基酸序列登錄號(hào)為AAR83243（重鏈）,AAR83244（輕鏈）.結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)室獲得了完整的鼠源性抗人cTnImAbFab段基因，為鼠抗人cTnI的人源化改造奠定了基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】抗體，單克隆；基因；序列分析；血清心肌鈣蛋白　　【Abstract】AIM:ToobtainthegeneofmurineanticTnIFabfragmentandanalysethenucleotideanddeducedaminoacidsequences.METHODS:ByRT

3、PCRmethod,thecDNAofanticTnImurineantibodyFabfragmentplifiedfromthehybridomacells.CloningandsubsequentsequenceanalysisoftheFabfragmented.Thededucedaminoacidsequenceate700and800basepairsplifiedusingIgGheavychainprimersandκlightchainprimers,respectively.Sequencean

4、alysisindicatedthatthededucedaminoacidsequencesinoacidpresentinthemurineIgG1Fabfragment(GenBankaccessionNOAY484430,AY484431;ProtEinBankaccessionNOAAR83243,AAR83244).CONCLUSION:ThecloningandsequencingofapletemurineanticTnIFabfragmentprovidesabasisfortheproduction

5、ofthechimericanticTnIantibody.　　【Keyonocolonal;genes;sequenceanalysis;cardiactroponinI　　0引言　　本室已有多株高特異高表達(dá)的鼠源性抗人cTnI細(xì)胞株，用來(lái)檢測(cè)心肌損傷時(shí)外周血中cTnI水平高低，顯示了較高的臨床診斷價(jià)值［1-4］.但由于鼠源性mAb的人抗鼠抗體反應(yīng)［5］，使之不能用于體內(nèi)診斷及作為治療心肌損傷的藥物載體，所以必須對(duì)其進(jìn)行人源化修飾，有關(guān)鼠源性抗人cTnI的人源化改造少見(jiàn)報(bào)道.本研究目的是將鼠源性抗cTnI抗體Fab段

6、基因克隆出來(lái)并進(jìn)行序列分析，為下一步制備嵌合抗體打下基礎(chǔ).　　1材料和方法　　1.1材料雜交瘤細(xì)胞株1株（JS200202），大腸桿菌E.coliDH5α由本室保存.pMD18T載體購(gòu)自TaKaRa公司.TaqDNA聚合酶，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司）；IPTG(異丙基βD半乳糖苷)，XGal(5溴4氯3吲哚半乳糖苷)為上海生物工程公司產(chǎn)品.質(zhì)粒小量抽提試劑盒為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品，G03SL離心式高純質(zhì)粒大量抽提試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品.　　1．2方法　　1．2．1PCR引

7、物設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的小鼠Fab段的Fd基因和輕鏈基因、FR1和第一恒定區(qū)3′端的保守的基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增Fd基因和輕鏈基因的5′端和3′端引物.重鏈Fd段5′端引物：H1:5′SAKGTGCAGCTCGAGSAGTCAGGACCT3′；H2:5′GAGGTYCAGCTCGAACARTCTGGACCT3′；H3:5′CAGGTCCAACTCGAGCAGYCTGGGKCT3′；H4:5′GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGRGCAGCTCGAGGAGTCTGGGGGA3′；輕鏈基因的5′端引物1：5′

8、CCTCTAGAGACATCCAGATGAMCCAGTCTCC3′；2：5′CCTCTAGAGACATYKTGCTGACYCARTCTCC3′；3：5′CCTCTAGARACATTGTRATGACMCARTCTCC3′；4：5′CCTCTAGAGACATYCAGMTGACYCAGTCTCC3′；5：5