資源描述：
《抗河豚毒素單鏈抗體的制備》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、福建農(nóng)林大學(xué)碩士畢業(yè)論文摘要河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一種小分子非蛋白毒素，毒性極強，人畜誤食后均能致死。TTX是典型的鈉離子通道抑制劑，中毒者出現(xiàn)肢體麻木、癱瘓等癥狀，嚴重的可導(dǎo)致死亡。TTX人體致死劑量約為0．5mg／70kg。缺乏簡單有效的檢測方法。在本研究中，我們獲得了用于制備TTx檢測試劑盒的基因工程單鏈抗體，對1vrX進行檢測。TTX為小分子物質(zhì)，分子量僅有319．26，本身只有反應(yīng)原性，不具免疫原性。若直接以其進行動物免疫，不能產(chǎn)生免疫效果。將TTX與鑰孔假血蘭蛋白(keyholelimpethemocyanin，KL
2、H)通過化學(xué)方法連接構(gòu)成具有免疫原性的完全抗原，作為小鼠免疫用抗原；將TTX與牛血清蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)通過化學(xué)方法連接，作為檢測用抗原。選取6．8周齡，健康的Balb／c小鼠雌性小鼠作為免疫動物進行免疫，加強免疫數(shù)次后，測小鼠血清中anti—TTX抗體效價。當血清效價達到一定值后，取效價最高的小鼠，處死后提取脾臟總RNA。提取的RNA經(jīng)檢測后，通過RT-PCR獲得eDNA第一鏈。以上述cDNA為模板，經(jīng)PCR得到抗體重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因VL，以編碼(Gly4Ser)3的核苷酸序列作為linker，通過交錯
3、延伸PCR將VH和VL基因組裝為完整的scFv基因。將scFv基因克隆入噬菌體載體pCANTAB．5E中，構(gòu)建了噬菌體單鏈抗體庫。經(jīng)過6輪淘選，最終從噬菌體抗體庫中篩選到一株親和力較高的單鏈抗體、VY5。關(guān)鍵詞g河豚毒素RT-PCR單鏈抗體噬菌體展示ELISA福建農(nóng)林大學(xué)碩士畢業(yè)論文AbstractTetrodotoxin(tetrodotoxin,TT)()，asmallmolecule，non—protein,highlytoxictoxin,cancausehumanbeingsandanimalsdeadifitiseatenbymistake
4、．TTXisatypicalsodiumionchannelinhibitor,canledtolimbnumbness，paralysisandothersymptoms．evenseriouslytodeath．HumanlethaldoseofTTXisaboutO．5mg／70kg,butwelacksimpleandeffectivedetectionmethodsforTTXSOfar．Inthisstudy,weobtainedgeneticallyengineeredsingle-chainantibodyagainstTTXforth
5、epreparationofTTXdetectionkit．TTX，whosemolecularweightisonly319．26，hasonlyreactivityandCannotprovokeimmunesystem．SoTTXWasconnectedtokeyholelimpethemocyaninⅨLH)bychemicalmethodtoconstructcompleteantigen,whichhadimmunogenicityandthenWasusedasantigen．TTXWasalsoconnectedtobovineseru
6、malbumin03SA)fordetection．HealthyBalb／cfemalemiceof6-8weeksagewereusedforimmunization．Afterseveraltimesstrengtheningimmune，miceserumtiterWastested．Oncetheserumtiterreachedahi．ghvalue，miceWassacrificedandtotalRNAWasextractedfromthespleens．ThefirsteDNAstrandwassynthesizedbyRT-PCRf
7、rommRNA．ThenVM(heavychainvariableregion)andVL(1ightchainvariableregion)wereobtainedfromeDNAtemplatebyPCR．Subsequently,anucleotidesequencewhichencodethesmallpeptide(GlynSe03WasusedasalinkertoconstructscFvgenebyoverlapextensionPCR．ThenscFvgeneWasclonedintothephagevectorpCANTAB一5Et
8、oconstructasingle-chainphageantibodylibrary．Aft
