從大容量抗體庫(kù)中篩選抗tnfα人單鏈抗體

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1、從大容量抗體庫(kù)中篩選抗TNFα人單鏈抗體：王欲曉,喬媛媛,周麗君,王琰【摘要】目的:從天然的單鏈大容量噬菌體抗體庫(kù)中篩選特異性的抗TNFα的人單鏈抗體（scFv）。方法:以TNFα為抗原,通過(guò)“吸附洗脫擴(kuò)增”過(guò)程從大容量抗體庫(kù)中篩選特異性抗體,對(duì)其抗原結(jié)合活性和序列進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果:經(jīng)過(guò)4輪篩選,獲得62個(gè)與TNFα結(jié)合的陽(yáng)性克隆,其中27個(gè)特異性結(jié)合的克隆,指紋分析有7種不同的可變區(qū)片段;其中5種獲得可溶性表達(dá);基因序列分析表明其輕重鏈分屬VλⅠ和VHⅣ亞群。結(jié)論:利用單鏈大容量抗體庫(kù)技術(shù)可以不經(jīng)免疫制備獲得特異性抗TNFα的scFv,為今后的研

2、究和應(yīng)用提供依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】大容量噬菌體抗體庫(kù);TNFα;噬菌體抗體腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactorα,TNFα）是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì),研究發(fā)現(xiàn)TNFα水平的升高與多種病理過(guò)程有關(guān)。如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、感染及創(chuàng)傷引起的休克、炎癥性腸病(Crohn’s)及移植物抗宿主病等?？筎NFα單克隆抗體(mAb)對(duì)這些病理過(guò)程可以起拮抗作用,從而可能對(duì)許多疾病有治療作用［1］。目前國(guó)外已將抗TNFα抗體作為治療RA、Crohn’s等的藥物正式進(jìn)入臨床并顯示出良好的應(yīng)用前景。由于鼠源mAb具有異源性,限制了其在人體內(nèi)的應(yīng)用,人抗體的制備難

3、度很大?？贵w庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)為人抗體的制備提供了有效手段。我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了大容量噬菌體抗體庫(kù),并從中篩選出多種針對(duì)不同抗原的特異性抗體［2］。本實(shí)驗(yàn)擬從大容量噬菌體抗體庫(kù)中篩選出抗TNFα的人單鏈抗體(scFv),為今后的研究和應(yīng)用提供依據(jù)。1材料和方法1．1材料大腸桿菌菌株XL1Blue、Bs1365、無(wú)琥珀抑制子的大腸桿菌菌株HB2151和VCSM13為本室保存;大容量噬菌體抗體庫(kù)為本室構(gòu)建,詳細(xì)過(guò)程見(jiàn)文獻(xiàn)［2］;重組人TNFα抗原由我實(shí)驗(yàn)室表達(dá)和純化;限制性內(nèi)切酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品;卵清蛋白（OA）和鐵蛋白（Fer）購(gòu)自Sigma公司、各種酶標(biāo)抗體購(gòu)自

4、Promega公司和Sigma公司;抗原管（Immunotube）購(gòu)自丹麥NUNC公司。1.2方法1.2.1大容量噬菌體抗體庫(kù)工作庫(kù)的制備原始噬菌體抗體庫(kù)以100∶1的比例（multiplicityofinfection,MOI=100）超感染BS1365細(xì)胞,37℃水浴保溫1h,使多副本載體進(jìn)入同一個(gè)細(xì)胞［2,3］,加2YT至400mL,補(bǔ)足Amp100mg/L振蕩培養(yǎng)至OD=0.5左右加5mL輔助病毒VCSM13(pfu=1.7×1012),30℃培養(yǎng)過(guò)夜,次日收集噬菌體抗體庫(kù),測(cè)定滴度。再以MOI≤1的比例感染1000mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的XL1Blue菌,3

5、7℃靜止30min,取少許鋪含Amp的培養(yǎng)盤(pán)計(jì)算庫(kù)容,補(bǔ)足Amp,加入10mLVCSM13,30℃過(guò)夜,次日回收上清,常規(guī)PEG沉淀,獲得工作庫(kù)。1.2.2抗TNFα抗體的篩選將TNFα用0.05mol/L碳酸鹽Buffer稀釋至100mg/L,以1mL包被免疫管,4℃過(guò)夜,次日用30g/L脫脂奶粉封閉2h,加入1mL噬菌體抗體庫(kù)（約1×1013個(gè)CFU）,37℃孵育2h,以含0.5mL/LTL新鮮XL1Blue菌直接感染,37℃孵育15min,轉(zhuǎn)入10mLSB培養(yǎng)液中;再將細(xì)菌感染回收后的免疫管中加入1mL洗脫液（0.1mLHCl,以甘氨酸調(diào)至pH至2.2

6、）37℃靜置15min再進(jìn)行洗脫回收。用吸管將洗脫液吸出后,加入45μL2mol/LTris中和,再加入2mLXL1Blue細(xì)胞37℃靜置15min,加入7mL的SB培養(yǎng)液。從2次回收的菌液分別取出適量鋪氨芐青霉素培養(yǎng)盤(pán)測(cè)定滴度（CFU）,其余菌液37℃培養(yǎng)3h,擴(kuò)大體積到100mL,加入1.7×1012pfu輔助病毒VCSM13,30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。每輪篩選后均測(cè)定次級(jí)庫(kù)的滴度,并計(jì)算噬菌體抗體的投入產(chǎn)出比（回收率）,作為特異性噬菌體抗體富集的指標(biāo)。次日回收上清,常規(guī)PEG沉淀,所得次級(jí)噬菌體抗體庫(kù)再進(jìn)行下一輪的篩選［4,5］。1.2.3噬菌體抗體的篩選從篩選

7、第三、第四的培養(yǎng)盤(pán)隨機(jī)挑取集落在含有Amp的2YT培養(yǎng)液中過(guò)夜,第2天取30μL細(xì)菌到1mLSB培養(yǎng)液中,37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,加入輔助病毒VCSM13,30℃培養(yǎng)過(guò)夜,收取上清即得到噬菌體抗體。1.2.4ELISA試驗(yàn)鑒定噬菌體抗體將抗原稀釋至10mg/L,以50μL包被ELISA板,1h后棄去孔內(nèi)液體,用30g/L脫脂奶PBS封閉后加入噬菌體抗體液,37℃孵育1h,用0.5g/LTAb進(jìn)行反應(yīng),洗滌后加入OPD底物顯色,讀取A490值。1.2.5可變區(qū)基因的多樣性分析（DNA指紋）從篩選到的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒,以此為模板,PCR擴(kuò)增scFv基因,PCR產(chǎn)物用

8、CL6B