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1、人抗HBsAg單鏈抗體作者:孟艷玲，溫偉紅，薛茜，賈林濤，鮑煒，劉家云，任君琳，薛采芳，李英輝，王成濟，楊安鋼【關鍵詞】肝炎表面抗原GeneconstructionandexpressionofhumanantiHBsAgsinglechainFvTatfusionprotEininE.coli 【Abstract】AIM:ToconstructafusiongeneofhumanantiHBsAgScFvTatandtoanalyzethebindingactivityandinternalizationofScFvTatfusionprotEInafteritsexpressionin
2、E.coli.METHODS:TersplifytheScFvgene.TheconstructionainTat.Theexpressedproteinatography.ThebindingspecificityoftheScFvTatfusionproteinedbyindirectELISAandspecificinternalizationoftheScFvTatfusionproteinedbyimmunocytochemistrystainingafterthepurifiedproteinacells.RESULTS:Restrictionendonucleasedigest
3、ionandDNAsequencingprovedthatScFvgeneedthattheexpressionproductshadantigenspecificbindingactivity.ScFvTatfusionproteinacells.CONCLUSION:TheantiHBsAgScFvTatfusionproteinexpressedinE.colicanspecificallyinternalizeintoHBsAgpositivehepatocellularcarcinomacells. 【Keyersham公司產品；6HismAb為第四軍醫(yī)大學免疫學教研室制備；HR
4、P羊抗鼠IgG為武漢博士德生物有限公司產品；ECL化學發(fā)光試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒為美國Pierce公司產品；組織化學染色試劑盒為福州邁新生物有限公司產品. 1.2方法 1.2.1引物的設計與合成根據已有的抗體序列,我們設計了相應的引物,分別引入了XhoⅠ與EcoRⅠ酶切位點.引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成,序列如下:5′端引物:5′TTTCTCGAGGAGGTGCAGCTGGTGGAG，3′端引物:5′TTTGAATTCTTATCGATTGATTTCCACCTT.其中橫線部分分別為XhoⅠ與EcoRⅠ酶切位點，方框內為終止密碼子TAA的互補序列. 1.2.2ScFv基因重組
5、表達載體的構建及鑒定以質粒pEGFPN3HBs11為模板進行PCR擴增，擴增片段純化后，用XhoⅠ與EcoRⅠ雙酶切,連接入表達載體pTATHA中，轉化大腸桿菌DH5α后，篩選陽性克隆,酶切鑒定.對酶切鑒定正確的克隆進行序列測定，測序由北京賽百盛生物技術有限公司完成.測序正確的質粒命名為pTATHAHBs11. 1.2.3ScFv融合基因的誘導表達及鑒定將鑒定正確的重組質粒pTATHAHBs11轉化大腸桿菌BL21，挑取單克隆，接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，次日以1∶100接種，37℃培養(yǎng)至A600nm達0.6左右，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，誘導培養(yǎng)3h，
6、取1mL未誘導及誘導菌液離心收集菌體，以PBS重懸，超聲裂菌后離心，沉淀重懸于10mL/LTritonX100,上清和重懸后的沉淀分別加入等量2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，離心后取上清進行SDSPAGE分析，凝膠薄層掃描分析蛋白純度.同時對表達產物進行B顯色，終止反應后測定各孔450nm光吸收值.②ELISA競爭抑制實驗.取純化蛋白25μL，與25μLPBST稀釋的HBsAg(10mg/L)混勻，加入HBsAg包被的ELISA板孔內，以未加HBsAg的純化蛋白25μL（純化蛋白25μL和25μLPBST）為對照，其余步驟同間接ELISA，共設三個復孔.在酶聯(lián)儀上讀取A值并計算抑制率{抑
7、制率=［1-A（加HBsAg）/A（未加HBsAg）］×100}.③免疫細胞化學染色檢測表達產物的特異性內化.制備HepG2.2.15和HepG2細胞爬片，加入純化蛋白，使其終濃度為0.5mg/L,37℃孵育1h,40g/L多聚甲醛固定30min,0.1mL/LTritonX100處理，30mL/LH2O2滅活內源性過氧化物酶，再以二抗同源的正常動物血清進行封閉，依次加入一抗、生物素化的二抗和SABC復合物，
