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1、抗河豚毒素之基因工程單鏈抗體制作方法探析第二章噬菌體展示的概述1896年，在印度的Gangs和Jumna兩條河的中，英國(guó)的細(xì)菌學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一些未知生物，它們具有明顯的抵抗霍亂弧菌的作用。1971年，法國(guó)的研究人員發(fā)現(xiàn)了一個(gè)奇怪的現(xiàn)象，他們將一種無(wú)菌的污水濾液加入到新鮮的志賀痢疾桿菌的液體培養(yǎng)物中后，發(fā)現(xiàn)志賀痢疾桿菌被分解了，并且原來(lái)渾濁的液體培養(yǎng)物變得澄清，說(shuō)明在這種無(wú)菌的污水濾液中存在著某種未知的生物或者物質(zhì)[107，108]。后來(lái)被證明了，他們之前所發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象是由一種被稱為噬菌體的生物造成的。他們發(fā)現(xiàn)的那
2、些未知的生物正基因工程的論文是噬菌體。噬菌體（phage）是一種病毒，它的宿主是細(xì)菌等微生物，如：細(xì)菌、真菌、放線菌、螺旋體等微生物。噬菌體在環(huán)境中和生物體中是廣泛存在的，與自然界中的其他生物一樣，都促使著整個(gè)自然的平衡發(fā)展。噬菌體展示技術(shù)是一種分子技術(shù)，通過(guò)這種技術(shù)，我們可以將外源蛋基因工程藥物的論文白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面。這時(shí)噬菌體就成為了一種表達(dá)載體，它不僅可以表達(dá)自身核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，還可以表達(dá)插入的外源基因編碼的蛋白質(zhì)，同時(shí)還保留著復(fù)制繁殖的能力，進(jìn)而使外援蛋白得到大量的表達(dá)。利用該技術(shù)，我們
3、可以插入大量的變異的、不同的核苷酸序列，這樣就會(huì)對(duì)應(yīng)的在噬菌體顆粒表面表達(dá)出不同的、變異的多肽，然后我們可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行篩選。本文將會(huì)從基本的噬菌體展示技術(shù)的概念和噬菌體載體的選擇、展示系統(tǒng)的分類和應(yīng)用及前景展望多個(gè)方面進(jìn)行綜述。2.1噬菌體展示技術(shù)的概念和噬菌體載體的選擇2.1.1概念噬菌體展示，在噬菌體顆粒的表面表達(dá)外源的多肽，進(jìn)而將噬菌體定位到不同的目標(biāo)分子上。這一項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)演變?yōu)橐环N在新藥發(fā)現(xiàn)和確定工程多肽的新功能上的功能強(qiáng)大的新技術(shù)[109-113]。當(dāng)我們將外源的DNA片段插入到線性的噬菌體
4、的基因組中后，由外源基因片段編碼的外源多肽就會(huì)以一種融合蛋白的方式與噬菌體自身的包衣蛋大學(xué)基因工程論文白融合表達(dá)在噬菌體顆粒的表面。在噬菌體顆粒表面展示多肽這項(xiàng)技術(shù)和建立一個(gè)重組的多肽庫(kù)的概念相結(jié)合，可以作為一種篩選我們目的物的一種新技術(shù)。這個(gè)想法的最初實(shí)現(xiàn)在1985年，當(dāng)時(shí)就是選擇了線性的噬菌體作為表達(dá)的載體[114]。在1985年，Sm轉(zhuǎn)基因技術(shù)論文ith建立了在噬菌體顆粒表面表達(dá)多肽的這種技術(shù)，他用一種病毒去侵染大腸桿菌，這種線性噬菌體（如：M13）相比于其他的噬菌體（如：T4），它不僅可以自我復(fù)制組
5、裝，而且還不會(huì)殺死宿主細(xì)胞。由于史密斯的這一項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性的工作，建立在這種溫和噬菌體的基礎(chǔ)上的噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)演變成為了一種被廣泛使用在一個(gè)分子庫(kù)中篩選我們所需要的功能或性能的目的蛋白或多肽的一種技術(shù)。噬菌體展示系統(tǒng)的最基本原則就是，多肽的表型和基因型是相一致的。在實(shí)踐中表達(dá)的蛋白或者多肽通常都是和噬菌體的外殼蛋白pIII或pVIII蛋白融合表達(dá)的[115]。這樣的融合蛋白一般都都在其N端有一個(gè)適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列將其定向到細(xì)菌的周質(zhì)空間或者細(xì)胞內(nèi)部[116]。在噬菌體組裝過(guò)程中，表達(dá)的融合蛋白也被納入新生的噬菌體
6、顆粒中?？梢跃幋a外源蛋白的遺傳信息被整合到相同的噬菌體顆粒的單鏈DNA（ssDNA）分子上。所以，基因型和表型的耦合是發(fā)生在噬菌體被釋放的細(xì)胞外環(huán)境之前，這樣可以確保從相同的細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的噬菌體克隆是完全相同的。在這種方式下，通過(guò)一個(gè)批量克隆的基因庫(kù)可以創(chuàng)建一個(gè)容量大約在1010pfu/mL的巨大的噬菌體展示庫(kù)。多數(shù)應(yīng)用噬菌體展示庫(kù)的目的是確定可以和一個(gè)給定的目標(biāo)分子綁定的目的多肽。富集那些已經(jīng)展示了我們的目的多肽的噬菌體克隆的主要方法就是通過(guò)從噬菌體庫(kù)中固定化親和選擇。在這種篩選的方法中，我們收集可以結(jié)合
7、的噬菌體，那些不能結(jié)合的噬菌體通過(guò)一定的緩沖液洗掉，然后將結(jié)合的噬菌體稀釋并通過(guò)重新感染大腸桿菌的方式來(lái)擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的噬菌體可以用于進(jìn)行下一輪的篩選。這是很典型的噬菌體庫(kù)篩選要涉及到的步驟。簡(jiǎn)而言之，噬菌體庫(kù)的篩選是一個(gè)選擇富集談后擴(kuò)大培養(yǎng)的循環(huán)過(guò)程。第二章抗河豚毒素的噬菌體抗體文庫(kù)的構(gòu)建和淘選...............................................................35第二篇研究?jī)?nèi)容...................................
8、.......................................................................................19第一章河豚毒素人工完全抗原的制備.......................................................................................19第三章SCFV-T53的性質(zhì)
