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1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文KGF--1的聚乙二醇N--不端定點(diǎn)修飾及修飾產(chǎn)物性能研究姓名：孫傳傳申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：藥理學(xué)指導(dǎo)教師：李校堃2012-05-22溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文KGF．1的聚乙二醇N．末端定點(diǎn)修飾及修飾產(chǎn)物性能研究中文摘要第一章KGF．1的PEG定點(diǎn)修飾目的：建立對KGF．1進(jìn)行PEG定點(diǎn)化學(xué)修飾的工藝研究，優(yōu)化兩種常見修飾劑PEG-丁醛及PEG．馬來酸酰亞胺(PEG．MAL)的修飾條件和分離純化條件，對修飾后所得產(chǎn)物的活性、空間結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、體內(nèi)藥動學(xué)性質(zhì)、抗肝損傷作用等生物性能進(jìn)行評價。
2、方法：選擇PEG一丁醛及PEG．MAL作為化學(xué)修飾劑，對影響聚乙二醇定點(diǎn)修飾的5個主要影響因素：蛋白濃度、反應(yīng)物的摩爾質(zhì)量比、反應(yīng)液pH值、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間進(jìn)行條件優(yōu)化，設(shè)計一系列實(shí)驗(yàn)，摸索出能得到高修飾率和單修飾產(chǎn)物的修飾條件。根據(jù)PEG修飾對蛋白電荷的影響，利用離子交換色譜分離獲得修飾蛋白。此外，為了判定PEG修飾KGF．1是否是單一修飾，我們采用了MALDI．TOF修飾前后蛋白的分子量進(jìn)行比較測定：采用N．端測序即Edman降解的方法來確定KGF．1的N一末端是否被聚乙二醇分子所占據(jù)；采用用圓二色譜法檢
3、測PEG修飾對KGF．1的空間結(jié)構(gòu)的影響；采用NⅢ3T3細(xì)胞對修飾后產(chǎn)物的促增殖活性及激活MAPK／Erk通道活性的作用進(jìn)行檢測。在系統(tǒng)考察修飾蛋白熱穩(wěn)定、酶穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性基礎(chǔ)上利用ELISA法分析了修飾蛋白在SD大鼠體內(nèi)血藥濃度變化的特征并測得了相應(yīng)蛋白的體內(nèi)半衰期；采取腹膜腔內(nèi)注射四氯化碳的方法對修飾后蛋白的抗肝損傷作用進(jìn)行考察。結(jié)果：優(yōu)化影響蛋白藥物聚乙二醇修飾的5個主要參數(shù)，得出對KGF．1蛋白進(jìn)行PEG修飾的最佳條件：pH為6．5的20mM的PBS緩沖液，KGF一1與PEG的摩爾質(zhì)量比為1：10，
4、KGF．1濃度為lmg／ml，25℃反應(yīng)24h，PEG．丁醛和PEG．MAL最佳修飾條件基本相同，只是PEG—MAL的修飾過程中需要添加尿素才可得到較好的修飾效果。對修飾后產(chǎn)物的分離純化，首先采用SepharoseG25柱上對蛋白樣品脫鹽，進(jìn)而根據(jù)修飾前后蛋白對肝素結(jié)合力的差異采用肝素親和層析方法分離純化，結(jié)果顯示該色譜方法分離效果好，修飾蛋白的純度超過95％。MALDI—TOF．MS結(jié)果表明經(jīng)過PEG一丁醛和PEG．MAL化學(xué)修飾后，PEG．KGF．1分子量分別為38．2kDa和37．6kDa，提示只有一個P
5、EG分子連接到KGF．1：N．末端測序結(jié)果顯示野生型的KGF．1的N．端序列為Ser-Tyr-Asp．Tyr-Met，而修飾后PEG．KGF．1的N末端殘基未被檢測出來，表明PEG修飾為針對KGF．1蛋白N．末端的定點(diǎn)修飾反應(yīng)。CD結(jié)果顯示修飾前后4溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文KGF一1遠(yuǎn)紫外吸收趨勢相同，表明PEG修飾對KGF．1的二級結(jié)構(gòu)基本無影響。修飾前后蛋白均能誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞的有絲分裂，其中PEG．MAL修飾雖然獲得的修飾率較高，但其活性只有野生型蛋白的17．3％，活性較差；PEG．丁醛．KGF．1相對
6、活性為89．6％，活性較好。另外修飾后蛋白可引發(fā)激烈的Erkl和Erk2磷酸化反應(yīng)，表明PEG一丁醛單分子修飾KGF．1對KGF一1的增殖活性無顯著影響。穩(wěn)定性充分表明經(jīng)過PEG．丁醛修飾后的蛋白熱穩(wěn)定性、抵抗酶降解能力以及抑制酸水解能力均有了顯著的提高：另外，體內(nèi)血藥濃度檢測結(jié)果進(jìn)一步表明PEG．丁醛修飾顯著延長了KGF．1體內(nèi)半衰期(達(dá)到28h)，相比修飾前蛋白提高了將近8倍?？垢螕p傷作用實(shí)驗(yàn)顯示，PEG．KGF．1明顯降低CCl4致大鼠肝損傷血清的川日、AST值，減輕CCl4對肝細(xì)胞的病理損傷，表明KGF
7、．1經(jīng)修飾后具有良好的預(yù)防和治療CCl4急性損傷的作用。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)基于一種重要的功能蛋白KGF．1穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短的缺陷提出了通過PEG定點(diǎn)修飾來改善KGF．1上述缺陷的新思路，本文重點(diǎn)考察了PEG．MAL和PEG．丁醛兩種最常用的定點(diǎn)修飾制劑對KGF．1修飾的影響，通過比較分析，得出PEG．丁醛相比于PEG-MAL無論是修飾工藝還是修飾產(chǎn)物性能方面均具有明顯的優(yōu)勢，在此基礎(chǔ)上建立了PEG．丁醛修飾產(chǎn)物的純化工藝，并研究和證實(shí)了PEG．丁醛修飾的KGF一1穩(wěn)定性顯著提高、體內(nèi)半衰期顯著延長，其對CCl4
8、引起的肝損傷保護(hù)作用也要顯著優(yōu)于修飾前蛋白，該研究為克服和解決KGF．1工業(yè)應(yīng)用和臨床推廣過程中存在的缺陷提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)思路。關(guān)鍵詞：角化細(xì)胞生長因子KGF．1，PEG定點(diǎn)修飾，分離純化，穩(wěn)定性，體內(nèi)半衰期，抗肝損傷作用溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文AbstractN—terminalSite—SpecificPEGyaltionofKGF1andThebiologicalacti
