rhfgf--2的n末端固相peg修飾及修飾產(chǎn)物的性能研究

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1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文rhFGF--2的N末端固相PEG修飾及修飾產(chǎn)物的性能研究姓名：葉朝輝申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：藥理學(xué)指導(dǎo)教師：李校堃；黃志鋒2012-05-22溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文rhFGF．2的N末端固相PEG修飾及修飾產(chǎn)物的性能研究中文摘要目的：建立一種新型PEG化學(xué)修飾工藝一以肝素瓊脂糖色譜柱作為固相載體的固相修飾，改善rhFGF．2在液相PEG修飾時出現(xiàn)的單一修飾率不高，活性低等缺陷。優(yōu)化rhFGF．2在固相條件下N末端PEG修飾條件及分離純化條件，對修飾產(chǎn)物的活性、受體結(jié)合能力、空間結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性和胰蛋白酶穩(wěn)定性、免疫

2、反應(yīng)性以及生物學(xué)半衰期等生物學(xué)性能進(jìn)行評價。方法：本研究采用的固相修飾主要在肝素瓊脂糖色譜柱上進(jìn)行，首先將蛋白結(jié)合到肝素柱上，然后將mPEG20kDa．丁醛反應(yīng)液作為流動相，作低流速循環(huán)，反應(yīng)一定時間后高鹽洗脫收集得到修飾混合物備用。在液相修飾的基礎(chǔ)上，我們對影響固相反應(yīng)的2個主要參數(shù)，即反應(yīng)過程中rhFGF．2與PEG的摩爾質(zhì)量比和反應(yīng)時間進(jìn)行了優(yōu)化。摸索出一種有效的分離方法，以期得到高純度的PEG．rhFGF．2。考慮到rhFGF．2修飾前后肝素親和性可能會有變化，我們直接在肝素柱上進(jìn)行了分離純化，然而結(jié)果不是特別理想。根據(jù)修飾前后

3、蛋白的分子量差異：rhFGF．2為16kDa，而PEG．rhFGF．2則為36kDa左右，我們嘗試采用S．100等分子篩層析法。然而，分子篩層析法對修飾產(chǎn)物無法進(jìn)行有效分離，之后我們根據(jù)疏水性的變化采用HiTrapOctylFF等疏水層析進(jìn)行分離，但是結(jié)果依舊不好。最后我們采用HiTrapSPFF等強(qiáng)陽離子交換成功實現(xiàn)了對修飾產(chǎn)物的分離純化，并且考察對主要影響因素如洗脫緩沖液離子強(qiáng)度等進(jìn)行考察，得到一個優(yōu)化條件。對分離純化后的PEG—rhFGF-2，我們采用SDS．PAGE和RP．HPLC進(jìn)行了鑒定。此外，我們通過MALDI—TOF—M

4、S檢測PEG．rhFGF．2的分子量，并以此確定蛋白的PEG修飾程度；采用Edman降解法測定蛋白N．端的5個氨基酸，確定PEG是否與rhFGF．2的N末端殘基偶聯(lián)；采用NIH3T3細(xì)胞分別檢測PEG．rhFGF．2促增殖活性及激活MAPK通路的活性；SPR檢測rhFGF．2修飾前后與FGFRl的結(jié)合能力變化：CD檢測PEG修飾對rhFGF．2的二級結(jié)構(gòu)有無影響：ELISA法檢測修飾蛋白的免疫反應(yīng)性；熱穩(wěn)定性實驗和胰酶蛋白降解實驗檢測修飾蛋白的穩(wěn)定性；大鼠靜脈給藥實驗檢測修飾前后rhFGF．2的生物學(xué)半衰期變化。結(jié)果：優(yōu)化影響PEG修飾

5、的主要參數(shù)，得出PEG固相修飾的優(yōu)化條件是：20mM，pH6．0磷酸鹽緩沖液，rhFGF-2與PEG的摩爾質(zhì)量比為1：8，室溫反應(yīng)8h。與液相修飾相比，本研究采用的修飾方法，明顯提高了修飾產(chǎn)物的單一修飾率，修飾率達(dá)58．3％。通過一系列的純化實驗，得出的結(jié)論是：離子交換(SPFF)能夠分離出純度較高的PEG-rhFGF-2，純化條件是：上樣緩沖液為20mM，pH7．0的磷酸鹽溶液，洗脫液為含0．30MNaCl．5．溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文的磷酸鹽緩沖液，pH7．0。SDS．PAGE和RP．HPLC的結(jié)果顯示得到的修飾產(chǎn)物純度達(dá)95％以上。

6、MALDI．TOF．MS的結(jié)果表明PEG—rhFGF一2的分子量為37．7kDa，并且PEG．rhFGF．2N端測序顯示前五個循環(huán)的結(jié)果都是陰性，上述結(jié)果表明一分子PEG特異性結(jié)合到了一分子rhFGF一2的N．端a．氨基上。此外，生物學(xué)活性實驗及SPR實驗結(jié)果表明，本研究采用的固相PEG修飾方法對rhFGF一2的生物學(xué)活性無顯著影響，且與液相PEG修飾相比，其更好的保留了rhFGF-2的活性；CD結(jié)果顯示修飾前后rhFGF．2遠(yuǎn)紫外吸收趨勢相同，表明固相PEG修飾對rhFGF．2的二級結(jié)構(gòu)基本上無影響；PEG．rhFGF．2無論是熱穩(wěn)定

7、性還是抗胰蛋白酶水解能力均得到了較大程度地提高；ELISA實驗顯示出修飾后的rhFGF-2在體外與抗體的結(jié)合能力僅為野生型的51％，這表明修飾后PEG長鏈遮蔽了抗體的部分結(jié)合位點，免疫反應(yīng)性明顯降低。另外，大鼠體內(nèi)半衰期結(jié)果表明，rhFGF．2經(jīng)過PEG修飾后體內(nèi)半衰期由原來10．39min延長到53．45min，幾乎是原來的5．2倍。結(jié)論：本研究建立了穩(wěn)定高效的rhFGF．2固相PEG定點修飾及純化工藝，PEG．rhFGF．2不但保留了蛋白的生物學(xué)活性而且其熱穩(wěn)定性、抗胰蛋白酶水解能力著提高、免疫反應(yīng)性降低、體內(nèi)半衰期顯著延長，這為拓

8、展rhFGF-2和其他蛋白類藥物的臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)和研究思路。關(guān)鍵詞：固相PEG修飾；rhFGF一2；分離純化；生物學(xué)活性；穩(wěn)定性．6．溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文Solid-·PhaseN--ter