g-csf對(duì)大鼠腦缺血再灌注模型腦組織內(nèi)vegf表達(dá)的影響與腦保護(hù)作用

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1、內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文(2008年)G—CSF對(duì)大鼠腦缺血再灌注模型腦組織內(nèi)VEGF表達(dá)的影響及腦保護(hù)作用腦血管病是危害人類(lèi)生命與健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，具有患病率高、復(fù)發(fā)率高、致殘率高、死亡率高、并發(fā)癥多的“四高一多”特點(diǎn)。而在所有腦血管病中以腦梗死的發(fā)病率最高，約占80％左右，給社會(huì)和家庭生活帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。所以找到腦梗死有效的治療方法是神經(jīng)病學(xué)的研究重點(diǎn)。超早期溶栓是治療腦梗死較為有效的方法，但其嚴(yán)格的時(shí)間窗使這項(xiàng)治療的應(yīng)用受到了極大限制。雖然神經(jīng)干細(xì)胞技術(shù)為缺血性腦損傷的治療帶來(lái)新的希望，但倫理學(xué)、細(xì)胞來(lái)源、移植損傷和排斥反

2、應(yīng)等因素限制了其臨床應(yīng)用。因此尋找更為有效、更具可操作性的腦梗死治療方法顯得尤為重要。近年來(lái)，人們嘗試用粒細(xì)胞集落刺激因子(Gran山ocyteCOlony—stimulatingFactor，G—CSF)作為動(dòng)員劑，促使存在于骨髓中的造血干細(xì)胞進(jìn)入外周血液循環(huán)來(lái)修復(fù)壞死心肌取得明顯的效果。實(shí)驗(yàn)證明，G—CSF能使外周血干細(xì)胞數(shù)量增加，促使急性心肌梗死(AMI)后心肌和血管再生，減少心肌梗死面積，改善心功能，但是對(duì)于G—CSF促進(jìn)心肌梗死區(qū)毛細(xì)血管增生的機(jī)制還不清楚。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞也可以進(jìn)人中樞系統(tǒng)并分化為神經(jīng)干細(xì)胞、促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的

3、分泌?，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。最新的研究顯示，G—CSF可以對(duì)抗谷氨酸介導(dǎo)的小腦顆粒細(xì)胞死亡[2]，也可以抑制局部缺血區(qū)炎性因子腫瘤壞死因子一Q(硼盯一alpha)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(烈OS)的表達(dá)[3]。這可能也是G—CSF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用的部分機(jī)制。任何組織的修復(fù)均離不開(kāi)血液系統(tǒng)。在G—CSF治療缺血性疾病的實(shí)驗(yàn)中觀察到，皮下注射G—CSF能促進(jìn)大鼠腦和心肌損傷區(qū)毛細(xì)血管的生成[4]。血管新生是一個(gè)復(fù)雜的生理和病理過(guò)程，許多因子參與調(diào)節(jié)。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是促進(jìn)血管生成的重要因子。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VascularEnd

4、othdialGr。1哦hFkt。rⅥ巳GF)，又稱(chēng)血管通透性因子(Ⅵ)F)，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，另外平滑肌、骨骼肌細(xì)胞也可產(chǎn)生。其作用包括增加血管通透性和促進(jìn)血管增生，是內(nèi)皮細(xì)胞選擇性有絲分裂原。ⅦGF是血管生成的主要刺激因子，其它血管生成因子的血管生成作用全部或部分通過(guò)增強(qiáng)Ⅵ三GF的表達(dá)發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VEGF不僅可以通過(guò)刺激局部血管新生，為缺血區(qū)提供營(yíng)養(yǎng)支持，還可以通過(guò)磷脂酰肌醇一3激酶(P13一I<／Akt)途徑抑制Bc卜2內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文(2008年)和su而vm的下調(diào)，這兩種蛋白與抗

5、凋亡和抗興奮性氨基酸毒性有關(guān)，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用‘5

6、。雖然實(shí)驗(yàn)顯示ⅥⅪF在腦組織可以發(fā)揮保護(hù)作用，但由腦缺血缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)源性VEGF表達(dá)數(shù)量很少，由此產(chǎn)生的自身修復(fù)能力有限。為了觀察在腦梗死模型中，G—CSF對(duì)腦組織VEGF是否存在刺激作用，是否可以通過(guò)刺激VEGF表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用G—CSF治療腦缺血性疾病提供理論依據(jù)，我們采用在局灶性腦缺血再灌注大鼠皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子的方法，觀察其對(duì)動(dòng)物神經(jīng)功能缺失評(píng)分、腦梗死面積比及腦梗死周?chē)鷵p傷區(qū)組織中VEGF表達(dá)的影響等，探討其腦保護(hù)作用的可能機(jī)制o1．材料與方法1．1主要

7、儀器、試劑及試劑配制1．1．1實(shí)驗(yàn)試劑兔抗大鼠ⅦGF試劑盒’淞試劑盒和Ⅸ蝎顯色劑四紅氮唑(丁rC)試劑粒細(xì)胞集落刺激因子水合氯醛PBS緩沖液1．1，2實(shí)驗(yàn)儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱(Jc303型)全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)生物組織包埋機(jī)(JBM—A型)切片機(jī)kicall50C標(biāo)本冷卻臺(tái)LeicaHIl210展片機(jī)卯一B烤片機(jī)光學(xué)顯微鏡圖像處理軟件數(shù)碼相機(jī)1．1．3主要溶液的配制天津津脈生物工程有限公司上海科豐化學(xué)試劑有限公司山東科興生物制品有限公司包鋼醫(yī)院藥劑科福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司上海成順儀器儀表有限公司沈陽(yáng)市龍首電子儀器有限公司天津久圣醫(yī)療電

8、子儀器有限公司德國(guó)LEICA舢135上海萊卡儀器有限公司天津儀器有限公司德國(guó)0I．YMPUSBx60江蘇捷達(dá)JD80l型形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)PanasonicDMC—I，1OGK內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文(2008年)PBS緩沖液：福建邁新PBS緩沖液一小袋溶于2000“蒸餾水中備用。1vrC染色液：避光將0．5邸粉末加入25“PBs中，配成2％的染色液，放人4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?％多聚甲醛液：稱(chēng)取多聚甲醛粉末409，加入1000ml蒸餾水，煮沸、攪拌，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的多聚甲醛固定液。枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液的配制：福建邁新公司枸櫞酸鹽一小

9、袋融入2000“蒸餾水中備用，PH值：6．0。粒細(xì)胞集落刺激因子：將G—CsF150越加入30Ild生理鹽水中，配成5刪“的G—CSF稀釋液。1．2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔Wistar大鼠40只，體重20