資源描述：
《膠體金免疫層析技術(shù)檢測犬細小病毒抗體方法的建立》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2007屆碩士研究生畢業(yè)論文2犬細小病毒流行病學(xué)研究夏咸柱(1993)認為，CPV-2主要感染犬，偶爾可感染其他犬科和鼬科動物，各種年齡品種的犬均易感，幼齡犬和純種犬易感性和病死率高。本病一年四季均可發(fā)生，但以寒冷季節(jié)多發(fā)，各種應(yīng)激均可誘使本病發(fā)生。有報道從狐貍、獵豹、西伯利亞虎、狼以及貉中檢測或分離到了CIW-2，可見CPV-2的宿主范圍有不斷擴大的趨勢，能在種間傳播流行，不斷進化。最初，犬細小病毒病的暴發(fā)是以高發(fā)病率和高死亡率為特征的。現(xiàn)在這樣的暴發(fā)已經(jīng)很少出現(xiàn)了，絕大部分成年犬是獲得疫苗免疫或自
2、然感染獲得免疫的，疫病主要發(fā)生在6周到6月齡的幼犬，它們出生后一月齡內(nèi)依靠母源抗體保護，母源抗體的半衰期是9．7d，當(dāng)抗體效價降低后，幼犬變得對病毒易感。病犬是主要的傳染源，犬在感染的第3d首次通過糞便向外界排毒，早期散播的病毒散在，傳染性強。后期由于腸粘膜]gA的產(chǎn)生和隨出血進入腸道的IgM等CPV-2抗體的增多，病毒被凝集成團，血凝效價降低甚至消失，感染性也降低。犬自然感染主要通過消化道感染病毒，人工感染可通過皮下、肌肉和靜脈接種病毒引起發(fā)病。最小感染劑量尚不清楚，但似乎小至100個TCID50，而感染動物排
3、泄的病毒量相當(dāng)高，可達100億TClD50／g，以及病毒在環(huán)境中的高耐受性，都說明了CPV-2在世界范圍內(nèi)流行的原因了。3犬細小病毒抗原檢測研究3．1病毒分離CPV-2能在原代貓?zhí)ツI細胞，原代犬胎小腸、腎、脾和胸腺細胞，浣熊唾液腺細胞，牛胎脾細胞，水貂肺細胞系(CC=L-64)以及犬貓的腎傳代細胞系(MI)CK、CRVK)中增殖和傳代?，F(xiàn)常用F81、MDCK等傳代細胞系分離培養(yǎng)病毒，CPV-2增殖可引起FSl細胞拉網(wǎng)、脫落、崩解和破碎等明顯的細胞病變，但在MDCK細胞中增殖，常無明顯細胞病變，需用接種后3巧d的單
4、層細胞作免疫熒光抗體染色，或取細胞培養(yǎng)液與豬紅細胞作凝集試驗來鑒別。Eugster等(1980)指出，只有在電鏡下病毒呈單個散在的糞便病料才適合進行病毒分離。糞便病料要用PBS10倍稀釋，然后加入1／10量的氯仿4℃處理15min，低速離心，上清同步接種細胞，因為CPV-2雖然無需輔助病毒即可在細胞核中自行復(fù)制，但需要宿主細胞有絲分裂過程中的某些功能的輔助。實驗研究證明，CPV-2的2膠體金免疫層析技術(shù)檢&《犬細小病毒抗體方法的建立基因組是在感染細胞的染色體開始復(fù)制以后才在細胞核內(nèi)合成的，說明本屬病毒的復(fù)制能力有
5、缺陷，必須在細胞培養(yǎng)的同時或最遲24h內(nèi)接種病毒，這樣才能使病毒良好增殖。細小病毒具有潛伏存在于組織細胞中的特點，當(dāng)進行病毒初代分離時，除了按常規(guī)方法用易感細胞進行分離培養(yǎng)外，還可用病料組織進行自體細胞培養(yǎng)，這種方法不僅能提高病毒的分離率，又能避免外來病毒的污染。病毒分離方法雖然在理論上可以檢出一個感染性的病毒粒子，確診ClW'-2的感染。但是也存在很多限制，分離病毒的操作繁瑣，代價高，需要較多的實驗設(shè)備，某些病毒增殖緩慢，常需要數(shù)周才能出現(xiàn)結(jié)果，這些都不利于細小病毒爆發(fā)時的早期診斷和控制。3．2電鏡檢查取疑似犬
6、細小病毒感染犬的糞便，加等量PBS，混勻，3000rpm離心15rain，取上清加等量氯仿，振蕩10rain，再重復(fù)上述離心處理，取上清，以2％磷鎢酸(pH6．2)進行負染后鏡檢。如進行免疫電鏡檢查，可見大塊凝集的病毒粒子。電鏡檢查敏感性不高，需要大量病毒粒子存在才能檢出，限制了該方法的應(yīng)用。3．3血凝試驗在pH6．O刁．2，溫度扣25℃的條件下，CPV-2能牢固地凝集豬、猴、馬和貓的紅細胞，經(jīng)福爾馬林滅活后，其血凝活性幾乎不變。由于豬紅細胞容易獲得，且血凝模式穩(wěn)定，所以通常選用豬紅細胞來測定細小病毒的血凝性，朱
7、君(2005)等摸索犬細小病毒的最佳血凝特性發(fā)現(xiàn)，0．5％醛化豬紅細胞在0．01M，pH6．8含有0．I％BSA的PBS緩沖液中，敏感性明顯提高，且試驗結(jié)果重復(fù)性好，反應(yīng)時間為1h。用PBS稀釋待檢糞便或細胞培養(yǎng)物，5009離心15rain，取上清，在96孔V型微量血凝板上作倍比稀釋，加l％新鮮或醛化的豬紅細胞，混勻，4"C靜置，陰性對照孔沉降為點時判讀結(jié)果，出現(xiàn)50％紅細胞凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)即為病毒的血凝效價。出現(xiàn)糞便帶血時，進入腸道的IgM等抗體可凝集CPV-2抗原，使其失去血凝活性，加入2-巰基乙醇處理
8、，可恢復(fù)部分病毒的血凝活性。血凝試驗靈敏，操作簡單，經(jīng)濟，但需要常備敏感性高的新鮮或醛化的豬紅細胞，試驗時間需要lh以上，如果血凝效價低，則需用血凝抑制試驗補充，所需時間更長。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2007屆碩士研究生畢業(yè)論文3．4酶聯(lián)免疫吸附試驗?zāi)壳?，國?nèi)外已經(jīng)研制出多種可供臨床使用的試劑盒。Mildbrand(1984)等研制針對CPV-2上兩個抗原決定簇的單克隆抗體，這兩種抗
