ngr修飾脂質(zhì)體的制備及其腫瘤靶向性研究

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1、廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是個(gè)人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)特別加以注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明并致謝。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名魚!煎B期：Ⅵlq年．}月弓。日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解廣州中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許被查閱和借閱。本人授權(quán)廣州中醫(yī)藥大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢

2、索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存和匯編本學(xué)位論文。(保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)論文作者簽名壑!亟一論文導(dǎo)師簽名日期：W}峰年f月弓p日p文∥彳影洋擗摘要IIIIIIIIIIIIIIIIIIlUlY2622811背景：采用配體修飾脂質(zhì)體能實(shí)現(xiàn)配體與受體的特異性結(jié)合，使藥物能達(dá)到定向傳遞，是現(xiàn)在抗腫瘤主動(dòng)靶向脂質(zhì)體的研究熱點(diǎn)之一。本文制備NGR導(dǎo)向磷脂化合物修飾(后面稱NGR修飾)的脂質(zhì)體，考察脂質(zhì)體的藥劑學(xué)性質(zhì)和細(xì)胞攝取特性以及其腫瘤血管靶向性和細(xì)胞內(nèi)藥物分布行為，為NGR修飾脂質(zhì)體的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。目的：1．合成并鑒定NGR導(dǎo)向磷脂化合物。2．研究NGR導(dǎo)向磷脂化合物

3、比例對(duì)脂質(zhì)體性質(zhì)的影響。3．考察NGR修飾脂質(zhì)體的腫瘤血管靶向性。4．考察不同磷脂組成對(duì)NGR修飾脂質(zhì)體性質(zhì)的影響。5．研究NGR修飾載藥脂質(zhì)體的抗腫瘤藥效和細(xì)胞內(nèi)藥物分布。方法：1．NGR導(dǎo)向磷脂化合物的合成與鑒定：將NGR多肽連接到1，2一二硬脂酰一SD．-甘油一3一磷脂酰乙醇胺一Ⅳ一[羧基(聚乙二醇)2000]銨鹽(DSPE—PEG2000一COOH)上，得到DSPE—PEG2000一NGR(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺一聚乙二醇2000一NGR)，即NGR導(dǎo)向磷脂化合物，將其與磷脂材料混合，制得NGR修飾的脂質(zhì)體，采用質(zhì)譜儀鑒定DSPE—PEG2000一NGR的分子量和采用HPLC—ELSD

4、進(jìn)行測(cè)定導(dǎo)向磷脂化合物NGR多肽的偶聯(lián)率。2．NGR導(dǎo)向磷脂化合物比例對(duì)脂質(zhì)體性質(zhì)的影響：分別選取0．32％、0．64％、1．28％NGR導(dǎo)向磷脂化合物三個(gè)比例，以薄膜蒸發(fā)法制備以香豆素一6為熒光探針的NGR修飾脂質(zhì)體，比較三種NGR修飾脂質(zhì)體的藥劑學(xué)性質(zhì)，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC，CDl3表達(dá))為細(xì)胞模型，采用流式細(xì)胞儀分析三種NGR修飾脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取的差異。3．NGR修飾脂質(zhì)體的腫瘤血管靶向性：分別以香豆素一6和Dir探針，以薄膜蒸發(fā)法制備NGR修飾與未修飾脂質(zhì)體。選用人成纖維肉瘤細(xì)胞(HTl080，CBl3高表達(dá))、HUVEC、人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HcAEC，CDl3無表達(dá)細(xì)胞

5、)作為細(xì)胞模型采用流式細(xì)胞儀考察脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取差異，采用激光共聚焦觀察脂質(zhì)體在細(xì)胞內(nèi)隨時(shí)間的分布。以接種HTl080的裸鼠為動(dòng)物模型，采用活體成像系統(tǒng)分析NGR修飾脂質(zhì)體的腫瘤血管靶向性和體內(nèi)的分布情況。MTT法考察NGR修飾與未修飾載藥脂質(zhì)體對(duì)靶細(xì)胞生長的影響。4．不同磷脂組成對(duì)NGR修飾脂質(zhì)體性質(zhì)的影響：選取SPC、ItSPC、DPPC、和復(fù)合磷脂(SPC：HSPC=3：1)四種不同磷脂組成來制各NGR修飾香豆素一6脂質(zhì)體，通過藥劑學(xué)性質(zhì)考察其穩(wěn)定性。以人成纖維肉瘤細(xì)胞(HTl080，CDl3高度表達(dá))為細(xì)胞模型，以接種HTl080的裸鼠為動(dòng)物模型，利用流式細(xì)胞儀考察脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取效

6、率，MTT法考察脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的生長影響。分別采用激光共聚焦觀察和活體成像系統(tǒng)分析不同磷脂組成脂質(zhì)體在細(xì)胞內(nèi)和裸鼠體內(nèi)的分布。5．NGR修飾的載藥脂質(zhì)體的抗腫瘤藥效和細(xì)胞內(nèi)藥物分布：采用MTT法考察了馬錢子生物類堿成分對(duì)肝癌細(xì)胞株S刪C7721的毒性。以HTl080為細(xì)胞模型，馬錢子總生物堿和馬錢子堿為藥物模型，用HPLC測(cè)定NGR修飾與未修飾的載藥脂質(zhì)體在不同時(shí)間下在細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。最后，采用AnnexinV—PI法和流式細(xì)胞儀分析了載藥脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的凋亡作用。結(jié)果：1．NGR導(dǎo)向磷脂化合物的合成與鑒定：成功合成NGR導(dǎo)向磷脂化合物，并測(cè)得的DSPE—PEfi2000～NGR的分子量為33

7、88．0，和理論的分子量相符。偶聯(lián)率為(51．59±4．69)％。2．NGR導(dǎo)向磷脂化合物比例對(duì)脂質(zhì)體性質(zhì)的影響：三種比例NGR修飾的脂質(zhì)體的包封率都在90％以上，性質(zhì)穩(wěn)定。在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)0．64％NGR導(dǎo)向磷脂化合物修飾的脂質(zhì)體細(xì)胞攝取明顯強(qiáng)于0．32％和1．28％修飾的脂質(zhì)體。3．NGR修飾脂質(zhì)體的腫瘤血管靶向性：在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，同一條件下，HTl080和HUVEC對(duì)NGR修飾脂質(zhì)體組攝取明顯高