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1、碩士學(xué)位論文基于KDR為靶點(diǎn)的靶向超聲微泡對(duì)腫瘤新生血管分子顯像的研究碩士研究生：位紅芹指導(dǎo)教師：李穎嘉教授摘要背景與目的：新生血管在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，隨著對(duì)腫瘤血管生成分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的逐漸深入，以腫瘤血管異質(zhì)性為基礎(chǔ)的血管功能性分子標(biāo)記物不斷開(kāi)發(fā)，使以腫瘤新生血管為靶點(diǎn)的腫瘤分子成像成為可能。現(xiàn)有的超聲造影劑粒徑多在1-gum左右，診斷條件下難以透過(guò)血管壁的細(xì)胞間隙進(jìn)入組織間質(zhì)，是真正意義上的血池造影劑，與其它在分子水平用于評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的影像學(xué)方法如CT、MⅪ，PET等比較，無(wú)造影劑外滲致背景信號(hào)增高的缺陷，造影增強(qiáng)信號(hào)完全來(lái)自于腫瘤血
2、管床，同時(shí)超聲技術(shù)具有較好的空間分辨率和實(shí)時(shí)顯像功能，操作簡(jiǎn)便，無(wú)輻射損傷，更適合用于腫瘤血管生成的研究。研究表明，在實(shí)體瘤發(fā)生的早期階段已有血管生成開(kāi)關(guān)的啟動(dòng)。KDR作為最重要的血管生長(zhǎng)因子VEGF的主要受體，介導(dǎo)VEGF的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管通透性增加等促血管生成活性，在腫瘤血管生成過(guò)程尤其是早期階段起著關(guān)鍵作用。本課題組前期的研究證實(shí)從人正常乳腺．單純?cè)錾堑湫驮錾橄僭话橄俳?rùn)性癌這一發(fā)生與演進(jìn)過(guò)程中，KDR表達(dá)逐漸增高增強(qiáng)，尤其在乳腺原位癌及乳腺浸潤(rùn)性癌的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈持續(xù)高表達(dá)，表明以KDR為靶點(diǎn)進(jìn)行乳腺癌新生血管分子顯像可能為乳腺癌的
3、早期診斷提供新的思路。KDR高摘要表達(dá)于乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多種腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示KDR可能成為多種實(shí)體瘤新生血管特異性分子顯像的靶標(biāo)并用于評(píng)價(jià)腫瘤血管生成狀態(tài)，估測(cè)預(yù)后及進(jìn)一步用于抗血管生成治療療效監(jiān)測(cè)。靶向超聲分子顯像在血栓、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化以及腫瘤新生血管的評(píng)價(jià)方面已取得初步成果。目前與超聲微泡連接用于超聲分子顯像的配體主要以抗體居多，抗體與靶細(xì)胞表面抗原結(jié)合特異性強(qiáng)，但抗體明顯的免疫原性，分子量過(guò)大，受其表面修飾位點(diǎn)限制顯像靈敏度不夠高的缺陷限制了以抗體為導(dǎo)向分子的靶向造影劑在體內(nèi)應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)中我們選擇分子
4、量小，與靶點(diǎn)結(jié)合特異性強(qiáng)的短肽作為與超聲造影劑結(jié)合的配體，將從噬菌體肽庫(kù)中篩選到的與KDR有高親和活性的12肽K237通過(guò)生物素．親和素橋與脂質(zhì)體微泡偶連，構(gòu)建靶向微泡，體外實(shí)驗(yàn)鑒定其生物活性，同時(shí)建立裸鼠移植瘤模型進(jìn)行超聲造影顯像，探討以l①R為靶點(diǎn)進(jìn)行乳腺癌新生血管分子靶向超聲顯像的可行性。材料與方法：1．短肽的合成．參照文獻(xiàn)方法固相合成與KDR有高親和活性的氨基酸序列為(HTMYYHHYQHHL)的生物素化十二肽以及含隨機(jī)序列的對(duì)照肽，高效液相色譜法測(cè)定化學(xué)純度，柱層析法進(jìn)行純化分離，收集主峰進(jìn)行質(zhì)譜分析。2．DiI紅色熒光標(biāo)記的靶向微泡的制備按摩爾比稱取
5、一定量的DSPC、DPPE．Biot于三頸瓶中，并加入DiI染料、PEG4000、泊洛沙姆(F188)，加251Ill蒸餾水，于70℃水浴攪拌30rain，放冷至室溫。把制好的脂質(zhì)混懸液加入50ml聚丙烯管內(nèi)，將剪切刀頭插至液面下，通入全氟丙烷2min氣體，以一定的剪切速度剪切一定時(shí)間，制得包裹全氟丙烷氣體的脂質(zhì)微泡，分裝于西林瓶中充入全氟丙烷氣體密閉，制備得到生物素化DiI紅色熒光標(biāo)記的脂質(zhì)微泡。生物素化脂質(zhì)微泡加入鏈親和素，冰上孵育30min，純化洗滌后再分別加入生物素化12肽或含隨機(jī)序列的對(duì)照肽，冰上孵育30min，洗滌純化后即制備出靶向微泡(MBp)和對(duì)
6、照微泡(MBc)，4"C冰箱保存。II碩士學(xué)位論文3．靶向微泡理化性質(zhì)鑒定同上述步驟制備生物素化的DiI紅色熒光標(biāo)記的普通微泡，加入鏈親和素，洗滌純化后加入FITC標(biāo)記的生物素化12肽，冰上孵育30min，洗滌純化后即制備出FITC標(biāo)記的靶向微泡(FITC—MBIo)。庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀進(jìn)行粒度分析，光鏡及熒光顯微鏡觀察微泡形態(tài)、熒光分布，熒光顯微鏡下觀察FITC綠色熒光標(biāo)記的小肽與DiI紅色熒光標(biāo)記的微泡的連接情況。4．靶向微泡體外靶向試驗(yàn)4．1．體外靶向試驗(yàn)：細(xì)胞免疫熒光及WesternBlot檢測(cè)人結(jié)腸癌癌LOVO細(xì)胞、人乳腺癌MDA．MB．231細(xì)胞、入結(jié)腸癌
7、LSl74T細(xì)胞KDR表達(dá)情況，DiI標(biāo)記的靶向微泡(MBp)及DiI標(biāo)記的對(duì)照微泡(MBc)分別與三種細(xì)胞孵育30min，DAPI染核后，普通光鏡及熒光顯微鏡下觀察微泡與三種細(xì)胞的粘附情況，取10個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞周圍粘附的微泡數(shù)量，比較三種細(xì)胞周圍粘附的微泡數(shù)量的差異。4．2．阻斷試驗(yàn)：將一定量的K237與LOVO細(xì)胞孵育30min后滴加DiI標(biāo)記的靶向微泡(MBp)，DAPI染核后，普通光鏡及熒光顯微鏡下觀察微泡與LOVO細(xì)胞的粘附情況，取lO個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞周圍粘附的微泡數(shù)量，并與未封閉組比較有無(wú)差異。4．3．統(tǒng)
8、計(jì)學(xué)分析：采用SPSSl
