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1、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理
2、啟動(dòng)子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)粒拷貝數(shù)轉(zhuǎn)錄翻譯Ptac=3Ptrp=11Plac啟動(dòng)子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtraATAGACATAATGTPlLTTGACAGATACTPrecATTGATATATAAT啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理具有多順反子結(jié)構(gòu)，基因排列次序?yàn)椋簡(jiǎn)?dòng)子（lacP）-操縱基因（lacO）-結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA）正調(diào)節(jié)因子CAP負(fù)調(diào)節(jié)因子lacI啟動(dòng)子Lac表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)
3、建的表達(dá)系統(tǒng)lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效轉(zhuǎn)錄cAMPCAPlacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄Lac表達(dá)系統(tǒng)正調(diào)節(jié)因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP復(fù)合物與lac操縱子上專一位點(diǎn)結(jié)合后，能促進(jìn)RNA聚合酶與–35、–10序列的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5cAMP葡萄糖代謝cAMP濃度降低cAMPCAPCAPLac表達(dá)系統(tǒng)lacUV5突變體PlacUV5突變體能夠
4、在沒有CAP存在的情形下非常有效的起始轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控，因此用它構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時(shí)比野生型Plac更易操作。Lac表達(dá)系統(tǒng)負(fù)調(diào)節(jié)因子lacI在無誘導(dǎo)物情形下，lacI基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動(dòng)子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。lacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶IPTGmRNATac表達(dá)系統(tǒng)tac啟動(dòng)子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的雜合啟動(dòng)子。調(diào)控模式
5、與lacUV5相似，但mRNA轉(zhuǎn)錄水平更高于trp和lacUV5啟動(dòng)子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有較高基因表達(dá)水平的情況下，選用tac啟動(dòng)子比用lacUV5啟動(dòng)子更優(yōu)越。啟動(dòng)子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATlac、tac啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求在普通大腸桿菌中，LacI阻遏蛋白僅能滿足細(xì)胞染色體上lac操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需要。當(dāng)多拷貝的lacO隨著帶有l(wèi)acUV5、tac啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌后，LacI阻遏蛋白與la
6、cO的比例顯著下降，無法保證每一個(gè)lacO都能獲得足夠的LacI阻遏蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。表現(xiàn)為在無誘導(dǎo)物存在的情形下，lacUV5、tac啟動(dòng)子有較高的本底轉(zhuǎn)錄。lac、tac啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求為了使以Lac、Tac表達(dá)系統(tǒng)具有嚴(yán)緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的能力，一種能產(chǎn)生過量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突變體lacIq被應(yīng)用于表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌JM109等菌株的基因型均為lacIq，常被選用為L(zhǎng)ac、Tac表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌。但是這些菌株也只能對(duì)低拷貝的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊調(diào)控，在使用高拷貝復(fù)制子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，仍能觀察到較高水平的本底轉(zhuǎn)錄
7、。需在表達(dá)載體中插入lacIq基因以保證有較多的LacI阻遏蛋白產(chǎn)生。lac、tac表達(dá)系統(tǒng)存在的問題IPTG用于誘導(dǎo)lac、tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但由于IPTG本身具有一定的毒性。從安全角度，對(duì)表達(dá)和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。一些國(guó)家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG解決方法lac和tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控乳糖替代IPTG誘導(dǎo)lac和tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄lac、tac表達(dá)系統(tǒng)存在的問題lac和tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控把阻遏蛋白LacI的溫度敏感突變體lacI(ts)、lacIq(ts)插入表達(dá)
8、載體或整合到染色體后，均能使lac和tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受到溫度嚴(yán)緊調(diào)控在較低溫度（30℃）時(shí)抑制，在較高溫度（42℃）時(shí)開放。用乳糖替代IPTG誘導(dǎo)lac和tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄乳糖在b-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具
