外源基因在大腸桿菌中表達簡略實驗步驟

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1、目的基因在大腸桿菌中的誘導表達一般程序如下：獲得目的基因－準備表達載體－將目的基因插入表達載體中（測序驗證）－轉(zhuǎn)化表達宿主菌－誘導靶蛋白的表達－表達蛋白的分析－擴增、純化、進一步檢測。[主要試劑]1、LB培養(yǎng)基。2、100mMIPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38gIPTG溶于100mlddH2O中,0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。[操作步驟]1、通過PCR方法獲得目的基因：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點，本實驗中為BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循環(huán)獲得所需基因片段

2、。PCR反應體系為：模板（含R基因的重組質(zhì)粒）1μl上游引物PR11μl下游引物1μldNTP（2.5mmol/L）5μl10×PCRbuffer（含Mg2+）10μlTaq酶1μlddH2O補至100μlPCR反應條件為：94℃變性3min；94℃變性3min、52℃復性40sec、72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸8min。2、構(gòu)建重組表達載體（1）載體酶切：將表達質(zhì)粒pRSETA用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用凝膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。（2）R基因PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4

3、DNA連接酶作用下連接入載體。連接反應體系為：pRSETA1μlR基因片段3μlT4DNA連接酶（5U/μl）1μl5×buffer2μlddH2O補至10μl3、獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種（1）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標志（抗Amp）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。（2）測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。（3）以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌BL21（DE3）的感受態(tài)細胞。4、誘導表達1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml

4、LB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養(yǎng)。2、按1∶100比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含100mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.5-0.8（最好0.6，大約需3hr）。3、取部分液體作為未誘導的對照組，余下的加入IPTG誘導劑至終濃度1mM作為實驗組，兩組繼續(xù)于37℃、200rpm震蕩培養(yǎng)3hr。4、分別取菌體1ml,，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl1%SDS重懸，混勻，70℃10min。5、離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。65500rpm15

5、min收集細胞7溶菌酶破碎細胞制備過柱上清8過柱純化帶組氨酸標簽蛋白