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《外源基因在大腸桿菌中表達(dá)簡(jiǎn)略實(shí)驗(yàn)步驟》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、目的基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)一般程序如下：獲得目的基因－準(zhǔn)備表達(dá)載體－將目的基因插入表達(dá)載體中（測(cè)序驗(yàn)證）－轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌－誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)－表達(dá)蛋白的分析－擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測(cè)。[主要試劑]1、LB培養(yǎng)基。2、100mMIPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38gIPTG溶于100mlddH2O中,0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。[操作步驟]1、通過(guò)PCR方法獲得目的基因：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)中為BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循環(huán)獲得所需基因片段
2、。PCR反應(yīng)體系為：模板（含R基因的重組質(zhì)粒）1μl上游引物PR11μl下游引物1μldNTP（2.5mmol/L）5μl10×PCRbuffer（含Mg2+）10μlTaq酶1μlddH2O補(bǔ)至100μlPCR反應(yīng)條件為：94℃變性3min；94℃變性3min、52℃復(fù)性40sec、72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8min。2、構(gòu)建重組表達(dá)載體（1）載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒pRSETA用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用凝膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。（2）R基因PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4
3、DNA連接酶作用下連接入載體。連接反應(yīng)體系為：pRSETA1μlR基因片段3μlT4DNA連接酶（5U/μl）1μl5×buffer2μlddH2O補(bǔ)至10μl3、獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種（1）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。（2）測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。（3）以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞。4、誘導(dǎo)表達(dá)1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml
4、LB（含Amp50μg/ml）中37℃過(guò)夜培養(yǎng)。2、按1∶100比例稀釋過(guò)夜菌，一般將1ml菌加入到含100mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.5-0.8（最好0.6，大約需3hr）。3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度1mM作為實(shí)驗(yàn)組，兩組繼續(xù)于37℃、200rpm震蕩培養(yǎng)3hr。4、分別取菌體1ml,，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl1%SDS重懸，混勻，70℃10min。5、離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。65500rpm15
5、min收集細(xì)胞7溶菌酶破碎細(xì)胞制備過(guò)柱上清8過(guò)柱純化帶組氨酸標(biāo)簽蛋白
