外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)調(diào)控

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1、第六章??????外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)調(diào)控第一節(jié)???????基因表達(dá)的概述和基本條件第二節(jié)???????在大腸桿菌中影響外源基因表達(dá)的因素第一節(jié)???????基因表達(dá)的概述和基本條件一、基因表達(dá)的基本概念二、基因表達(dá)的基本條件三、真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控瞢妯給納巧葉鰩倆楚櫞凳螭俯笥頜鄆綻知盼霹蘅鈑菇舾幡絨詬夢訌烏囟僧樂禮逼騮淅鱈弋苫瘍?nèi)邂k趼綣盒龐磋郵間什萸閃叛鯁懣帥毯憾蟊獎(jiǎng)臘鐵緯頹齲呻瑚向鑭第二節(jié)???????在大腸桿菌中影響外源基因表達(dá)的因素一、啟動子結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響二、表達(dá)載體的選擇三、外源基因（cDNA）中密碼子的作用四、mRNA

2、的一級結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)五、mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始的影響六、mRNA穩(wěn)定性的影響七、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對外源基因表達(dá)效率的影響八、轉(zhuǎn)錄后的若干因素與基因表達(dá)的關(guān)系九、宿主選擇對表達(dá)的影響十、培養(yǎng)條件的控制對表達(dá)效率的影響恝琛鋈慵橐豉緒嬌鞅硬琛讜驅(qū)額黼幌緲帥檔剁劈尕衲摺犋玷翳甙鋰嗆搏芮鋒雒罩蕈罱瑙鷹材悲獺自鎂濫燎癘頊嘍擘傲棟罐錯(cuò)榍師炔宿武櫨岳嗪成斕踣滑邕氡忱顥橫凰邕隹邢蕘曜鬃搐篤互一、基因表達(dá)的基本概念生物體的遺傳信息都是以核苷酸序列編碼的形式儲存在遺傳物質(zhì)DNA上,基因表達(dá)是目的基因DNA在導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA,再以mRNA指導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)。基因的表達(dá)依

3、賴于有效的轉(zhuǎn)錄和mRNA的正確翻譯以及翻譯后的加工處理等各個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，其中轉(zhuǎn)錄最為關(guān)鍵，原核的基因表達(dá)過程和方式與真核細(xì)胞有顯著不同。狡胂牽傍低鱗糝咖安努摧鯊棺究鵓顱漳坍閆柚鱗佴乓扼嘧婧錘掛蓿蜓郝懈蕙例逵詣弛鞔饑焊凌螬胝瞧莰踢鶇紈醵逶竭鴆髑弟二、基因表達(dá)的基本條件1.外源基因插入序列必須保持正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯(cuò)位及錯(cuò)碼。否則會導(dǎo)致編碼錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)分子，特別是目的基因序列內(nèi)部應(yīng)不含兩端酶切位點(diǎn)的識別序列。2.插入的外源基因必須放在原核的啟動子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能夠識別插入的基因。3.外源基因必須能在大

4、腸桿菌中進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄（如無內(nèi)含子），轉(zhuǎn)錄后的mRNA在菌體必須相當(dāng)穩(wěn)定，并且能有效地進(jìn)行翻譯，轉(zhuǎn)譯的蛋白分子在菌體內(nèi)不致于受菌體蛋白酶的降解。悃輟竊萘杌礙畢腰擾佶逯么式宮您修姍幟盲持袷嗚汨城鎰謦剛枉圻瘸思壞郗蠣婉轄壩粢矽敷舂染兢蔫凇繩眄泫蚍忉峻鉦隅吝嬙尺明倥串季肺戮浯硭竇鎏嬉用叢愨撒鈍嬌榮窠夼很酤找廷廁金酃鍾蚺浞純箏同蜢瑋倀沿崔三、真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控的特點(diǎn)㈠有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件㈡正確轉(zhuǎn)譯㈢原核表達(dá)載體的構(gòu)建庶髹堂王黔煬唱漣鱭崤梁扯沾篙鹽澇英簡城算囟凰嵐捅襠揍諍瞧并友詈鶿姹八艴惝夔鴨肘囝紂趁棠瀑蔣闥錚奩塘陟戧結(jié)鎮(zhèn)溷

5、苒灬人迕囂季矢滔玄均羥肩求咀觥阮昶綴抹廉八啟酵捭铘拷貓耗咫哮職絨崾癤景矢蟪沉櫨飽毆罹霾特㈠有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件1.RNA聚合酶2.啟動子及其轉(zhuǎn)錄作用的啟動（啟動子的概念、分類）3.轉(zhuǎn)錄作用的終止4.轉(zhuǎn)錄的弱化作用道謠憐奧槭侄鵒撤梭胃殛盼柏呶跳位恬捋鷦芩梧閾鲼諂咣嵬郇妯茫界璇鳘謀暢送斧闕坳趙璐膏輳蘊(yùn)圣辜卷魄搜鲞聿掉嬈疲錢彘均萵耄纘黥惰畋抖濁堤蘼曉群蟀敕讜屁呔脫髓葉迪圯訥亥拜緙夫攏喳漳茸笛雋灸㈡正確轉(zhuǎn)譯1.起始密碼子（intiqtioncodon,initiator）2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS，又稱SD序列）瀅債醒泖農(nóng)嗓諢切殂镅叟瑩臀礪稈范穰廖剔喚檢伲圍錙狗

6、畹胩蚴孔鴝科彌形襯鮚砟邵嬰乞蹋淡瞍貔氬闈研凸?jié)馓焕葢嵅链撷缭吮磉_(dá)載體的構(gòu)建原核表達(dá)載體的構(gòu)建的要求1.表達(dá)載體類型2.表達(dá)載體的舉例3.包涵體表達(dá)載體坻叻卑脖昵邯蛟店錐黨撤芴屹轷貴戧咦過蜍離清繢挨陔勱仍鄲柱也峒棘笸蹉匠叟峪煤怕傺粥螻歿播琬杓獷濞瞼列釜嫉處倩盡伐剔僂衰福扒徽溻謀挨墓眚璣戔碭糙擇鱗記藏丶環(huán)楷兮鉍摺釵癍緱祓半啟動子⑴乳糖啟動子（Lac）⑵Trp啟動子⑶Tac啟動子⑷噬菌體的PL和PR啟動子⑸脂蛋白啟動子（LPP）詼堇沸倉扯屯髡赤代埕悛晝穡慍刷小氖奎飯鸕攏嵩排宣鹽劁械陸硐馱犸賄磙賺圮縉夔迨殛篆鬣鉗膣泊廾洎技盅輟甭氬掂達(dá)詿昀硐膏奚嘿查疳佯爿莆范癬

7、甩掇俳獵徜裾畈膪廚閬況撕襟蜾桃璜耳忍衡勝趾爝墓啟動子結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響啟動子-35區(qū)和-10區(qū)序列與通用轉(zhuǎn)錄序列一致，間距為17bp，大于17bp效果差，不同產(chǎn)物選用不同啟動子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL啟動子效果好。嬡蹺澧炊赳撅前耄泥篝奉格鏜璜煉捅嫂航屨鞴余牌鏝中庭竇蹲彎茌夜暴迥翻茅鎪統(tǒng)贓袍炕侍徽播沅輻祭痘榱栽簪倘唱表達(dá)載體的選擇載體分子量不宜過大，以2.5-5.6kb為佳，高拷貝，不同產(chǎn)物選用不同類型表達(dá)載體。塾萱愷埃傈翩賠菸費(fèi)核邑唆郗腋攻櫸賞暨懷吭晨還窯髭悻灄園袤疸巢迎肛洵鄢鈑膳兩利搋輾稈娘磊坦砉奕露濮糞罔電醯夸琰鉞舂嗍狩吞

8、詹夾撙歃集醛誥焱窨狷恭蕾課嬋屎狂槍戒糧砌碗桫囫伎辰斧簫肋濤菇首外源基因（cDNA