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1、第七章______外源基因在真核細胞中表達及調控第一節(jié)_______真核細胞基因表達的調控第二節(jié)_______哺乳動物細胞表達系統的選擇標記基因第三節(jié)_______真核細胞表達系統的載體種類第一節(jié)_______真核細胞基因表達的調控一,真核生物基因表達的特點及優(yōu)勢二,真核細胞表達及調控元件第二節(jié)_______哺乳動物細胞表達系統的選擇標記基因一,胸苷激酶基因選擇標記(定義)二,二氫葉酸還原酶基因選擇標記三,新霉素抗性基因選擇標記四,氯霉素已酰轉移酶基因選擇標記五,黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶(XGPRT)基因第三節(jié)_______
2、真核細胞表達系統的載體種類一,載體的類型二,幾種常用的真核表達載體一,真核生物基因表達的特點及優(yōu)勢1.細胞的全能性2.轉錄和翻譯分開進行3.有相當大的非編碼區(qū)(調控序列)4.有三種不同RNA聚合酶參與轉錄5.初級轉錄產物能進行剪接加工修飾6.不存在操縱子結構7.基因多拷貝,功能基因分散在不同區(qū)域,分別轉錄二,真核細胞表達及調控元件(一)真核生物基因轉錄水平的調控(二)轉錄后水平的調控(三)翻譯水平的調控胸苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶(thymidineKinase,TK)在所有真核細胞中都有表達,是嘧啶生物合成補救
3、代謝途徑中的一個關鍵酶,它可催化胸苷磷酸化轉變成為dTMP,繼續(xù)磷酸化生成dTTP,參與DNA的生物合成.一,載體的類型1.質粒型載體2.病毒載體3.整合型表達載體4.游離型表達載體5.瞬時表達載體6.穩(wěn)定性表達載體7.非復制性HSV-Ⅰ病毒(單純皰疹病毒HSV-Ⅰ型)載體8.裂解性HSV-Ⅰ病毒載體二,幾種常用的真核表達載體一逆轉錄病毒載體1.卸甲載體2.穿梭載體二痘類病毒載體三HSV-Ⅰ單純皰疹病毒載體1.重組病毒型載體2.重組質粒型載體3.裂解型病毒載體(一)真核生物基因轉錄水平的調控基因調控的順式作用元件啟動子增
4、強子RNA剪接信號負調控元件終止子和polyA信號基因調控的反式作用因子概念反式作用因子主要作用規(guī)律(二)轉錄后水平的調控mRNA前體加工:轉錄的mRNA前體經5'加帽,3'酶切加尾去除內含子后,產生成熟mRNA,通過核孔進入胞質中.RNA編輯(RNAediting)(三)翻譯水平的調控翻譯起始序列eIF-2的磷酸化反應由模板來源的遺傳信息,進而可編碼產生不同氨基酸序列的多種蛋白質,這是生物適應性的保護措施.順式作用元件順式作用元件為一些能與DBP結合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,決定
5、轉錄起始位點和RNA聚合酶的轉錄按效應和功能可分為啟動子,增強子,RNA間接信號,負調控元件,終止子等調控元件.反式作用因子主要作用規(guī)律同一DNA序列可被不同蛋白質識別同一蛋白質因子可與多種不同DNA序列發(fā)生聯系,多數是通過蛋白質-蛋白質先相互作用后,再與DNA結合,發(fā)揮調節(jié)作用.反式作用因子的自身生物合成有相當大的可變性,可塑性.反式作用因子與順式作用元件相互作用的特定結構域,有兩種類型:通用轉錄因子的結構域為識別特異DNA的DNA結合結構域,如:鋅指結構.轉錄調節(jié)因子的結構域又稱轉錄活化結構域,如:酸性α-螺旋結構域
6、.不同結構域各自的特征不同結構域各自的特征通用轉錄因子的DNA結合結構域鋅指結構亮氨酸拉鏈螺旋-轉角-螺旋(HTH)螺旋-環(huán)-螺旋轉錄調節(jié)因子的轉錄活化結構域RNA編輯(RNAediting)RNA編輯是在轉錄時或轉錄后,能夠改變RNA分子編碼特性,是與剪切形式不同的一種修飾形式,如可使mRNA某位點密碼子CAA轉變?yōu)閁AA,使C變U,編輯的結果形成了UAA終止密碼子,在編碼酶的作用下,除使C變U,還可在RNA上添加多個U或呈單個C的添加,使前體mRNA變成成熟mRNA時,通過插入或替換方式,可改變和擴大原遺傳信息,編碼
7、多種蛋白,是生物的適應性保護.翻譯起始序列在ATG起始密碼子周圍要有5'-CCACCA-TGG-3'保守序列,以利mRNA翻譯起始,若發(fā)生突變,其翻譯水平可下降10倍.在起始AUG上游若有比較多的二級結構序列,也會影響翻譯,建議外源基因的5'端AUG上游序列不宜過長.eIF-2的磷酸化反應eIF-2為轉譯起始因子-2是蛋白質合成起始階段13種起始因子中最為關注的因子.若轉入動物細胞中的質粒DNA的兩條鏈一旦都發(fā)生轉錄,就會形成雙鏈互補mRNA,而激活胞內的雙鏈RNA激活的蛋白激酶(DAIPK)該激酶可使eIF-2的α-亞
8、基磷酸化,轉譯受抑,為防止該激酶活化,常在載體上加上腺病毒的VARNA基因,VARNA是由RNA聚合酶Ⅲ合成的小分子RNA,能阻止雙鏈RNA對DAI激酶的激活作用,使轉譯得以正常進行.一,胸苷激酶基因選擇標記外源基因+載體(TK+)的重組體導入TK-細胞中,在HAT(次黃嘌呤,氨基喋呤,胸腺嘧啶核苷)選擇培養(yǎng)基中篩選
