外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控

《外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、第七章______外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控第一節(jié)_______真核細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控第二節(jié)_______哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因第三節(jié)_______真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體種類第一節(jié)_______真核細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控一,真核生物基因表達(dá)的特點及優(yōu)勢二,真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件第二節(jié)_______哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因一,胸苷激酶基因選擇標(biāo)記(定義)二,二氫葉酸還原酶基因選擇標(biāo)記三,新霉素抗性基因選擇標(biāo)記四,氯霉素已酰轉(zhuǎn)移酶基因選擇標(biāo)記五,黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)基因第三節(jié)_______

2、真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體種類一,載體的類型二,幾種常用的真核表達(dá)載體一,真核生物基因表達(dá)的特點及優(yōu)勢1.細(xì)胞的全能性2.轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進(jìn)行3.有相當(dāng)大的非編碼區(qū)(調(diào)控序列)4.有三種不同RNA聚合酶參與轉(zhuǎn)錄5.初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能進(jìn)行剪接加工修飾6.不存在操縱子結(jié)構(gòu)7.基因多拷貝,功能基因分散在不同區(qū)域,分別轉(zhuǎn)錄二,真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件(一)真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控(二)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控(三)翻譯水平的調(diào)控胸苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶(thymidineKinase,TK)在所有真核細(xì)胞中都有表達(dá),是嘧啶生物合成補救

3、代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶,它可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為dTMP,繼續(xù)磷酸化生成dTTP,參與DNA的生物合成.一,載體的類型1.質(zhì)粒型載體2.病毒載體3.整合型表達(dá)載體4.游離型表達(dá)載體5.瞬時表達(dá)載體6.穩(wěn)定性表達(dá)載體7.非復(fù)制性HSV-Ⅰ病毒(單純皰疹病毒HSV-Ⅰ型)載體8.裂解性HSV-Ⅰ病毒載體二,幾種常用的真核表達(dá)載體一逆轉(zhuǎn)錄病毒載體1.卸甲載體2.穿梭載體二痘類病毒載體三HSV-Ⅰ單純皰疹病毒載體1.重組病毒型載體2.重組質(zhì)粒型載體3.裂解型病毒載體(一)真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控基因調(diào)控的順式作用元件啟動子增

4、強子RNA剪接信號負(fù)調(diào)控元件終止子和polyA信號基因調(diào)控的反式作用因子概念反式作用因子主要作用規(guī)律(二)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控mRNA前體加工:轉(zhuǎn)錄的mRNA前體經(jīng)5'加帽,3'酶切加尾去除內(nèi)含子后,產(chǎn)生成熟mRNA,通過核孔進(jìn)入胞質(zhì)中.RNA編輯(RNAediting)(三)翻譯水平的調(diào)控翻譯起始序列eIF-2的磷酸化反應(yīng)由模板來源的遺傳信息,進(jìn)而可編碼產(chǎn)生不同氨基酸序列的多種蛋白質(zhì),這是生物適應(yīng)性的保護措施.順式作用元件順式作用元件為一些能與DBP結(jié)合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,決定

5、轉(zhuǎn)錄起始位點和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄按效應(yīng)和功能可分為啟動子,增強子,RNA間接信號,負(fù)調(diào)控元件,終止子等調(diào)控元件.反式作用因子主要作用規(guī)律同一DNA序列可被不同蛋白質(zhì)識別同一蛋白質(zhì)因子可與多種不同DNA序列發(fā)生聯(lián)系,多數(shù)是通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)先相互作用后,再與DNA結(jié)合,發(fā)揮調(diào)節(jié)作用.反式作用因子的自身生物合成有相當(dāng)大的可變性,可塑性.反式作用因子與順式作用元件相互作用的特定結(jié)構(gòu)域,有兩種類型:通用轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域為識別特異DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,如:鋅指結(jié)構(gòu).轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的結(jié)構(gòu)域又稱轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域,如:酸性α-螺旋結(jié)構(gòu)域

6、.不同結(jié)構(gòu)域各自的特征不同結(jié)構(gòu)域各自的特征通用轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)亮氨酸拉鏈螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域RNA編輯(RNAediting)RNA編輯是在轉(zhuǎn)錄時或轉(zhuǎn)錄后,能夠改變RNA分子編碼特性,是與剪切形式不同的一種修飾形式,如可使mRNA某位點密碼子CAA轉(zhuǎn)變?yōu)閁AA,使C變U,編輯的結(jié)果形成了UAA終止密碼子,在編碼酶的作用下,除使C變U,還可在RNA上添加多個U或呈單個C的添加,使前體mRNA變成成熟mRNA時,通過插入或替換方式,可改變和擴大原遺傳信息,編碼

7、多種蛋白,是生物的適應(yīng)性保護.翻譯起始序列在ATG起始密碼子周圍要有5'-CCACCA-TGG-3'保守序列,以利mRNA翻譯起始,若發(fā)生突變,其翻譯水平可下降10倍.在起始AUG上游若有比較多的二級結(jié)構(gòu)序列,也會影響翻譯,建議外源基因的5'端AUG上游序列不宜過長.eIF-2的磷酸化反應(yīng)eIF-2為轉(zhuǎn)譯起始因子-2是蛋白質(zhì)合成起始階段13種起始因子中最為關(guān)注的因子.若轉(zhuǎn)入動物細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA的兩條鏈一旦都發(fā)生轉(zhuǎn)錄,就會形成雙鏈互補mRNA,而激活胞內(nèi)的雙鏈RNA激活的蛋白激酶(DAIPK)該激酶可使eIF-2的α-亞

8、基磷酸化,轉(zhuǎn)譯受抑,為防止該激酶活化,常在載體上加上腺病毒的VARNA基因,VARNA是由RNA聚合酶Ⅲ合成的小分子RNA,能阻止雙鏈RNA對DAI激酶的激活作用,使轉(zhuǎn)譯得以正常進(jìn)行.一,胸苷激酶基因選擇標(biāo)記外源基因+載體(TK+)的重組體導(dǎo)入TK-細(xì)胞中,在HAT(次黃嘌呤,氨基喋呤,胸腺嘧啶核苷)選擇培養(yǎng)基中篩選