外源目的基因表達(dá)與調(diào)控

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1、第六章外源目的基因表達(dá)與調(diào)控生物體的遺傳信息都是以核苷酸序列編碼的形式儲(chǔ)存在遺傳物質(zhì)DNA上,基因表達(dá)是目的基因DNA在導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA,再以mRNA指導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)。基因的表達(dá)依賴于有效的轉(zhuǎn)錄和mRNA的正確翻譯以及翻譯后的加工處理等各個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，其中轉(zhuǎn)錄最為關(guān)鍵，原核的基因表達(dá)過(guò)程和方式與真核細(xì)胞有顯著不同。外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。基因的轉(zhuǎn)錄是在RNA聚合酶的作用下合成mRNA，原核生物mRNA一般不需要轉(zhuǎn)錄后加工。真核生物mRNA在細(xì)胞內(nèi)合成，且需要經(jīng)過(guò)一繁殖加工過(guò)程：RNA剪接、5′端加帽、3′端加

2、上poly(A)尾巴。原核生物一般沒(méi)有翻譯后加工，真核生物有較復(fù)雜的翻譯后加工。第一節(jié)外源基因表達(dá)機(jī)制一、外源基因的起始轉(zhuǎn)錄外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子和相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問(wèn)題。理想的可調(diào)控的啟動(dòng)子在細(xì)胞生長(zhǎng)的初期不表達(dá)或低水平表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定的密度后，在某種特定誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)下，RNA聚合酶開(kāi)始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，合成mRNA。二、mRNA的延伸與穩(wěn)定性外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持mRNA的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵。為了防止mRNA在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的非特異性終止，可以在構(gòu)建表達(dá)載

3、體時(shí)加入抗終止的序列元件。在表達(dá)載體中加入正常轉(zhuǎn)錄終止序列，可以防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使mRNA的長(zhǎng)度限制在一定的范圍內(nèi)，增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。三、外源基因mRNA的有效翻譯外源基因在原核生物中的有效翻譯需要考慮：1.AUG(ATG)是首選的密碼子；2.SD序列為與核糖體16SrRNA互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序列至少含有AGGAGG序列中的4個(gè)堿基；3.SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離為3~9個(gè)堿基；4.在翻譯起始區(qū)的周圍的序列不易形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。真核細(xì)胞mRNA的5′非翻譯區(qū)不存在SD序列，但絕大多數(shù)mRNA的起始序列含有共同序列。不同生物使

4、用密碼子具有不同的偏好性。如果外源基因的mRNA密碼子使用受體的偏好密碼子，則表達(dá)效率高。mRNA上的終止密碼對(duì)正確翻譯的效率有很大影響。在原核細(xì)胞中，UAA為最常用的終止密碼子。四、表達(dá)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的穩(wěn)定性外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定積累，不被宿主蛋白酶所降解，可有效提高表達(dá)量。避免外源蛋白被宿主蛋白酶降解的措施:1.構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)。2.構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)。3.構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)。4.選擇蛋白酶缺陷型的受體系統(tǒng)。五、基因沉默基因沉默是導(dǎo)致外源基因不能正常表達(dá)的重要因素，主要出現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物中。目的基因沉默是在核酸水平上D

5、NA與DNA、DNA與RNA、RNA與RNA相互作用的結(jié)果。重復(fù)序列或同源序列是基因沉默的普遍原因之一，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)盡可能避免與內(nèi)源序列有較高的同源性。第二節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控元件一、啟動(dòng)子啟動(dòng)子是一段提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，一般位于表達(dá)基因的上游。1.序列特異性。在啟動(dòng)子的DNA序列中，通常含有幾個(gè)保守的序列框。2.方向性。啟動(dòng)子是一種有方向性的順式調(diào)控元件。3.位置特性。一般啟動(dòng)子只能啟動(dòng)其下游基因的轉(zhuǎn)錄。4.種屬特異性。二、增強(qiáng)子增強(qiáng)子是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列。1.雙向性。正反兩個(gè)方向調(diào)節(jié)活性。2.重復(fù)序列

6、。增強(qiáng)子一般含有能獨(dú)立行使功能的重復(fù)序列。3.功能與位置無(wú)關(guān)。4.特異性。組織特異性，或在特定細(xì)胞階段。5.對(duì)異源基因也有調(diào)節(jié)功能。三、終止子終止子是提供終止信號(hào)使RNA聚合酶停止轉(zhuǎn)錄的DNA序列。本征終止子指不需要其他蛋白輔助因子便可在特殊的RNA結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)實(shí)現(xiàn)終止作用。屬于強(qiáng)終止子。依賴型終止子需要ρ因子的輔助，屬于弱終止子。四、衰減子衰減子是基因表達(dá)調(diào)控的精細(xì)調(diào)節(jié)裝置，利用原核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯相偶聯(lián)的特性，依賴自身巧妙的特征序列和相應(yīng)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行地開(kāi)關(guān)式的微調(diào)作用，從而保證原核生物在相關(guān)操縱子處于阻遏的狀態(tài)下仍能以一個(gè)本底水平合成

7、氨基酸、核苷酸和抗生素等。五、絕緣子絕緣子長(zhǎng)約幾百個(gè)核苷酸，是通常位于啟動(dòng)子同正調(diào)控元件(增強(qiáng)子)或負(fù)調(diào)控因子之間的一種調(diào)控序列。絕緣子本身對(duì)基因的表達(dá)既沒(méi)有正效應(yīng)，也沒(méi)有負(fù)效應(yīng)，其作用只是不讓其他調(diào)控元件對(duì)基因的活化效應(yīng)或失活效應(yīng)發(fā)生作用。六、反義子反義RNA是一類與特定DNA序列互補(bǔ)的小分子RNA。編碼反義RNA的DNA稱為反義子。反義RNA廣泛存在于原核生物和真核生物中，在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯三個(gè)水平對(duì)基因的表達(dá)起著調(diào)節(jié)作用，其中以對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制最普遍。第三節(jié)外源基因表達(dá)與調(diào)控外源基因表達(dá)包括目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，

8、并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物(目的蛋白)。外源基因表達(dá)系統(tǒng)由基因表達(dá)載體和相應(yīng)的受體細(xì)