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1、第四節(jié)目的基因表達產物檢測 與分離純化一、外源目的基因表達產物的檢測外源目的基因的表達包括轉錄和翻譯兩個階段。外源基因表達產物的檢測過程就是對特異性mRNA或蛋白質的檢測。特異性mRNA的檢測:Northern雜交特異性蛋白質的檢測:ELISA,Western雜交1.Northern印跡雜交(Northernblot)檢測RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的區(qū)別靶核酸：RNARNA電泳:在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結構,保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基
2、汞變性電泳。轉膜：不需變性2.ELISA1971年瑞典學者Engvall和Perlmann，荷蘭學者VanWeeman和Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA）。ELISA原理使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶
3、催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關ELISA原理圖YY①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）ELISA可以分為直接法、間接法和夾心法等幾種。直接法：直接法是指酶標抗原或抗體直接與包被在酶標板上的抗體或抗原結合形成酶標抗原—抗體復合物，加入酶反應底物，測定產物的吸光值，計算出包被在酶標上的抗體或抗原的量。見圖a間接法：是將酶標記在二抗上，當抗體（一抗）和包被在酶標板的抗原結合形成復合物后，再以酶標二抗和復合物結合，通過測定酶反應產物的顏色可以（間接）反應一抗和抗原的結
4、合情況，進而計算出抗原或抗體的量。見圖b夾心法：是先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，再用酶標的抗體與抗原反應形成抗體-抗原-酶標抗體復合物；也可以象間接法一樣應用酶標二抗和抗體-抗原-抗體復合物結合，形成抗體-抗原-抗體-酶標二抗復合物，見圖C。前者稱為直接夾心法，后者稱為間接夾心法。ELISA基本的實驗過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應：先后加入被檢標本和酶結合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應而被結合固定酶促反應：在反應體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應而顯色E
5、LISA基本的實驗過程3.WesternBlot要檢測一個基因的表達產物是否正確，或者比較表達產物量的相對變化，首選方法是WesternBlot。Westernblot是生物學、生物化學、分子生物學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。Westernblot整個過程主要包括：PAGE電泳、轉膜及蛋白檢測3個階段。聚丙烯酰胺凝膠的組成及特點?組成：主要由丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N’-甲叉(亞甲基)雙丙烯酰胺(Bis)聚合而成。?聚合：單獨或混合時穩(wěn)定，出現(xiàn)自由基團時會聚合。化學法的引發(fā)劑：過硫酸銨（APSorAP)，催化劑：四甲基乙
6、二胺（TEMED)?特點：凝膠濃度越大，交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小。故根據(jù)分離蛋白質的大小選擇不同濃度的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）的原理聚丙烯酰胺凝膠的特點?優(yōu)點：聚丙烯酰胺凝膠電泳具有機械強度好、彈性大、透明、化學穩(wěn)定性高、無電滲作用、設備簡單、用樣量少(1～100μg)和分辨率高等優(yōu)點。?用途：蛋白質，核酸等物質的分離、定性和定量分析。WesternBlot基本原理經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載
7、體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測特定蛋白質的表達情況。Westernblot基本原理Figure1A.Inthedirectdetectionmethod,labeledprimaryantibodybindstoantigenonthemembraneandreactswithsubstrate,creatingadetectablesignal.1B.Intheindirectdetectionmethod,unlabeledprimaryan
8、tibodybindstotheantigen.Then,alabeledsecondaryantibodybindstotheprimaryantibodyandreactswiththesubstrate.A.DirectDete
