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1、第十章外源基因表達與基因工程藥物第一節(jié)概述外源基因的表達：利用細胞內相關酶系及其調控系統(tǒng)，將外源基因轉錄成肽鏈或加工成活性蛋白質的過程。具體的說，利用分子生物學技術，在體外將編碼外源蛋白質的基因重組至適宜的表達載體上，通過相關技術將其導入宿主細胞內，借助宿主細胞的轉錄、翻譯或翻譯后修飾酶系及相應的調控系統(tǒng)，在宿主細胞合成或分泌具有原有生物活性的蛋白質。目的：針對難以或無法從自然界直接提取、分離、純化所獲得的，或制造成本、產量規(guī)模等受限制的，或利用化學方法無法合成的多肽，蛋白質、酶這類生物分子藥物，利用細胞或組織或器官或生命體的復制、轉錄、翻譯及其調控系統(tǒng)以及
2、翻譯后加工、修飾等體系，按人的意愿生物合成這些生物分子，并從中將表達產物分離純化至預期程度，最終加工成藥品。基因工程概念基因工程(geneticengineering）是指采用人工方法將不同來源的DNA進行重組，并將重組后的DNA引入宿主細胞中進行增殖或表達的過程，從而改變生物特性或創(chuàng)造新的生物類型的技術基因工程的發(fā)展史一、基因表達基本原理基因表達(geneexpression)是指儲存遺傳信息的基因在各種調節(jié)機制下經過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個過程。典型的基因表達是基因經過轉錄和翻譯，產生有生物活性的蛋白質過程。基因工程技術的核心是基因表達技術?；?/p>
3、重組的主要目的是要使目的基因在某一細胞中能得到高效表達。基因表達在原核生物與真核生物中的差別原核生物與真核生物肽鏈合成過程的主要差別原核生物真核生物mRNA一條mRNA編碼幾種蛋白質（多順反子）一條mRNA編碼一種蛋白質（單順反子）轉錄后很少加工轉錄后進行首尾修飾及剪接轉錄、翻譯和mRNA的降解可同時發(fā)生mRNA在核內合成，加工后進入胞液，再作為模板指導翻譯核蛋白體30S小亞基＋50S大亞基?70S核蛋白體40S小亞基＋60S大亞基?80S核蛋白體起始階段起始氨基酰-tRNA為fMet-tRNAfMet起始氨基酰-tRNA為Met-tRNAiMet核蛋白體小
4、亞基先與mRNA結合,再與fMet-tRNAfMet結合核蛋白體小亞基先與Met-tRNAiMet結合，再與mRNA結合mRNA中的S-D序列與16SrRNA3?-端的一段序列結合mRNA中的帽子結構與帽子結合蛋白復合物結合有3種IF參與起始復合物的形成有至少10種eIF參與起始復合物的形成延長階段延長因子為EF-Tu、EF-Ts和EF-G延長因子為eEF-1α、eEF-1βγ和eEF-2終止階段釋放因子為RF-1、RF-2和RF-3釋放因子為eRF蛋白質合成的特點1.真核生物的蛋白質合成與mRNA的轉錄分開進行原核生物的蛋白質合成與mRNA的轉錄偶聯(lián)在一起
5、同時進行2.真核生物中的mRNA為單順反子原核生物中的mRNA為多順反子3.真核生物合成體系中的RNA和蛋白質在結構上與原核生物不同，且其線粒體有獨立的蛋白質生物合成體系阻遏蛋白介導的負調控和cAMP-CAP介導的正調控共同擔負著原核生物體內糖源的協(xié)調利用翻譯水平的調控是對原核生物轉錄水平的補充1.轉錄與翻譯的偶聯(lián)提高了基因表達調控的有效性2.SD序列影響翻譯起始速率3.翻譯阻遏利用蛋白與自身mRNA的結合實現(xiàn)翻譯起始的調控4.mRNA密碼子的編碼頻率影響翻譯的延伸速度基因表達調控的影響因素——原核生物（一）真核生物染色質結構影響基因轉錄1.轉錄活化的染色質
6、對核酸酶極為敏感2.轉錄活化的染色質的組蛋白發(fā)生改變3.RNA聚合酶結合位點的上游和下游具有不同的超螺旋構象4.CpG島甲基化水平降低（二）順式作用原件（啟動子、增強子和沉默子）直接影響基因表達活性（三）轉錄因子的調控（四）真核生物在轉錄后仍可控制mRNA的結構和功能，其在轉錄后層次不同于原核生物基因表達調控的影響因素——真核生物目標蛋白性質是否需要糖基化三維結構復雜程度簡單結構復雜的三維結構原核表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)是否二、基因表達基本類型原核細胞表達系統(tǒng)真核細胞表達系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)，芽孢桿菌系統(tǒng)等產物溶解情況表達位置產物結構狀態(tài)轉基因動植物酵母細胞、昆蟲細
7、胞和動物細胞等包涵體可溶性胞內定位表達分泌表達非融合表達融合表達第二節(jié)外源基因表達基本過程將外源基因通過體外重組后導入受體細胞，使該基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯和表達【四個要素】工具酶、載體、基因和受體（宿主）細胞基因工程的基本過程目的基因的獲?。簭纳矬w中分離或人工合成重組載體的構建：對目的基因和載體DNA進行剪切、修飾，在連接酶的作用下連接形成完整有復制能力的重組體重組DNA分子導入合適的受體細胞：重組DNA分子引入受體細胞中進行擴增基因工程的基本過程重組體的篩選與鑒定：直接篩選法(如抗藥標志選擇)和免疫學方法目的基因的表達及分離純化：原核與真核表
8、達一、目的基因的獲得外源基因表達的第一步是獲得目的基
