第十章外源基因表達(dá)與基因工程藥物

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1、第十章外源基因表達(dá)與基因工程藥物第一節(jié)概述外源基因的表達(dá)：利用細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶系及其調(diào)控系統(tǒng)，將外源基因轉(zhuǎn)錄成肽鏈或加工成活性蛋白質(zhì)的過程。具體的說，利用分子生物學(xué)技術(shù)，在體外將編碼外源蛋白質(zhì)的基因重組至適宜的表達(dá)載體上，通過相關(guān)技術(shù)將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，借助宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后修飾酶系及相應(yīng)的調(diào)控系統(tǒng)，在宿主細(xì)胞合成或分泌具有原有生物活性的蛋白質(zhì)。目的：針對難以或無法從自然界直接提取、分離、純化所獲得的，或制造成本、產(chǎn)量規(guī)模等受限制的，或利用化學(xué)方法無法合成的多肽，蛋白質(zhì)、酶這類生物分子藥物，利用細(xì)胞或組織或器官或生命體的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及其調(diào)控系統(tǒng)以及翻譯后加工、修飾等體

2、系，按人的意愿生物合成這些生物分子，并從中將表達(dá)產(chǎn)物分離純化至預(yù)期程度，最終加工成藥品?；蚬こ谈拍罨蚬こ?geneticengineering）是指采用人工方法將不同來源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過程，從而改變生物特性或創(chuàng)造新的生物類型的技術(shù)基因工程的發(fā)展史一、基因表達(dá)基本原理基因表達(dá)(geneexpression)是指儲存遺傳信息的基因在各種調(diào)節(jié)機(jī)制下經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個過程。典型的基因表達(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)過程?；蚬こ碳夹g(shù)的核心是基因表達(dá)技術(shù)?；蛑亟M的主要目的是要使目的基因在某一細(xì)胞中

3、能得到高效表達(dá)?；虮磉_(dá)在原核生物與真核生物中的差別原核生物與真核生物肽鏈合成過程的主要差別原核生物真核生物mRNA一條mRNA編碼幾種蛋白質(zhì)（多順反子）一條mRNA編碼一種蛋白質(zhì)（單順反子）轉(zhuǎn)錄后很少加工轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行首尾修飾及剪接轉(zhuǎn)錄、翻譯和mRNA的降解可同時發(fā)生mRNA在核內(nèi)合成，加工后進(jìn)入胞液，再作為模板指導(dǎo)翻譯核蛋白體30S小亞基＋50S大亞基?70S核蛋白體40S小亞基＋60S大亞基?80S核蛋白體起始階段起始氨基酰-tRNA為fMet-tRNAfMet起始氨基酰-tRNA為Met-tRNAiMet核蛋白體小亞基先與mRNA結(jié)合,再與fMet-tRNAfMet結(jié)合核蛋

4、白體小亞基先與Met-tRNAiMet結(jié)合，再與mRNA結(jié)合mRNA中的S-D序列與16SrRNA3?-端的一段序列結(jié)合mRNA中的帽子結(jié)構(gòu)與帽子結(jié)合蛋白復(fù)合物結(jié)合有3種IF參與起始復(fù)合物的形成有至少10種eIF參與起始復(fù)合物的形成延長階段延長因子為EF-Tu、EF-Ts和EF-G延長因子為eEF-1α、eEF-1βγ和eEF-2終止階段釋放因子為RF-1、RF-2和RF-3釋放因子為eRF蛋白質(zhì)合成的特點(diǎn)1.真核生物的蛋白質(zhì)合成與mRNA的轉(zhuǎn)錄分開進(jìn)行原核生物的蛋白質(zhì)合成與mRNA的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)在一起同時進(jìn)行2.真核生物中的mRNA為單順反子原核生物中的mRNA為多順反子3.真核

5、生物合成體系中的RNA和蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上與原核生物不同，且其線粒體有獨(dú)立的蛋白質(zhì)生物合成體系阻遏蛋白介導(dǎo)的負(fù)調(diào)控和cAMP-CAP介導(dǎo)的正調(diào)控共同擔(dān)負(fù)著原核生物體內(nèi)糖源的協(xié)調(diào)利用翻譯水平的調(diào)控是對原核生物轉(zhuǎn)錄水平的補(bǔ)充1.轉(zhuǎn)錄與翻譯的偶聯(lián)提高了基因表達(dá)調(diào)控的有效性2.SD序列影響翻譯起始速率3.翻譯阻遏利用蛋白與自身mRNA的結(jié)合實(shí)現(xiàn)翻譯起始的調(diào)控4.mRNA密碼子的編碼頻率影響翻譯的延伸速度基因表達(dá)調(diào)控的影響因素——原核生物（一）真核生物染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄1.轉(zhuǎn)錄活化的染色質(zhì)對核酸酶極為敏感2.轉(zhuǎn)錄活化的染色質(zhì)的組蛋白發(fā)生改變3.RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的上游和下游具有不同的超

6、螺旋構(gòu)象4.CpG島甲基化水平降低（二）順式作用原件（啟動子、增強(qiáng)子和沉默子）直接影響基因表達(dá)活性（三）轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控（四）真核生物在轉(zhuǎn)錄后仍可控制mRNA的結(jié)構(gòu)和功能，其在轉(zhuǎn)錄后層次不同于原核生物基因表達(dá)調(diào)控的影響因素——真核生物目標(biāo)蛋白性質(zhì)是否需要糖基化三維結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度簡單結(jié)構(gòu)復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)原核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)是否二、基因表達(dá)基本類型原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)，芽孢桿菌系統(tǒng)等產(chǎn)物溶解情況表達(dá)位置產(chǎn)物結(jié)構(gòu)狀態(tài)轉(zhuǎn)基因動植物酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和動物細(xì)胞等包涵體可溶性胞內(nèi)定位表達(dá)分泌表達(dá)非融合表達(dá)融合表達(dá)第二節(jié)外源基因表達(dá)基本過程將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受

7、體細(xì)胞，使該基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)【四個要素】工具酶、載體、基因和受體（宿主）細(xì)胞基因工程的基本過程目的基因的獲?。簭纳矬w中分離或人工合成重組載體的構(gòu)建：對目的基因和載體DNA進(jìn)行剪切、修飾，在連接酶的作用下連接形成完整有復(fù)制能力的重組體重組DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞：重組DNA分子引入受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增基因工程的基本過程重組體的篩選與鑒定：直接篩選法(如抗藥標(biāo)志選擇)和免疫學(xué)方法目的基因的表達(dá)及分離純化：原核與真核表達(dá)一、目的基因的獲得外源基因表達(dá)的第一步是獲得目的基