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1、外源基因表達(dá)與基因工程藥物01siRNA（小干擾RNA）：21-23nt，由長(zhǎng)dsRNA裂解而成的小片段，可誘導(dǎo)mRNA降解。siRNA主要參與抵御外源性病毒核酸的侵染。細(xì)胞中存在兩種RNA干擾現(xiàn)象：miRNA（微小RNA）：由miRNA前體剪切而成，可抑制mRNA翻譯。miRNA主要參與內(nèi)源性基因的表達(dá)調(diào)節(jié)。RNA干擾（RNAinterference,RNAi）siRNA(小干擾RNA)miRNA(微小RNA)來(lái)源siRNA是外源性的，是RNA干擾的中間產(chǎn)物miRNA是內(nèi)源的是生物體固有結(jié)構(gòu)si
2、RNA是雙鏈RNAmiRNA是單鏈RNADicer酶加工過(guò)程對(duì)稱地來(lái)源于雙鏈RNA不對(duì)稱加工，僅剪切miRNA的側(cè)臂作用位置siRNA可作用于mRNA的任何部位miRNA主要作用于靶標(biāo)基因3′端非翻譯區(qū)（3’-UTR）作用方式siRNA一般導(dǎo)致靶mRNA的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。miRNA可抑制靶mRNA的翻譯，也可以導(dǎo)致靶mRNA降解，即在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平起作用作用階段siRNA不參與生物生長(zhǎng)，主要作用是抑制病毒感染miRNA主要在發(fā)育過(guò)程中起作用，調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用基因
3、治療（基因失活性治療）（1）病毒感染性疾病通過(guò)RNAi抑制RNA病毒復(fù)制基因功能研究（功能失活策略）（2）基因過(guò)表達(dá)引起的疾?。ㄈ缒[瘤）siRNA藥物RNA干擾技術(shù)的實(shí)施策略體外合成siRNA、體內(nèi)轉(zhuǎn)錄shRNA基因打靶(genetargeting)利用同源重組原理對(duì)細(xì)胞特定內(nèi)源基因進(jìn)行改造的技術(shù)?；蚯贸╣eneknockout）：宿主基因組中特定功能基因的部分片段被同源的外源DNA片段替代，從而使靶基因失活?；蚯萌耄╣eneknockin）：外源功能基因與宿主基因組中的同源序列進(jìn)行同源重組
4、，插入到基因組中，從而在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)?；虼虬校╣enetargeting）基因敲除小鼠的產(chǎn)生1.體外構(gòu)建基因敲除載體：靶基因同源DNA序列+選擇性標(biāo)記基因2.將基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：顯微注射法、電穿孔法等3.篩選、鑒定發(fā)生了同源重組的ES細(xì)胞：標(biāo)記篩選法、分子鑒定法4.將ES細(xì)胞導(dǎo)入胚胎，胚胎植入假孕雌鼠的子宮5.小鼠交配傳代獲得特定的純合基因型子代小鼠Lepr8基因敲除小鼠比野生型小鼠（WT）出現(xiàn)明顯體重增加現(xiàn)象REGγ基因敲除鼠（下圖）出現(xiàn)脊椎彎曲等早衰現(xiàn)象Gab1基因敲除導(dǎo)致小鼠缺血
5、性血管新生、側(cè)枝循環(huán)建立出現(xiàn)缺陷（圖示上半部分），主要是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成的信號(hào)調(diào)控通路出現(xiàn)障礙而引起的（圖示下半部分）。酪氨酸酶基因敲除后，本來(lái)是黑色的小豬，變成了白色，表現(xiàn)出典型的白化病特征?；蚓庉嫞╣eneediting）對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。CRISPR/Cas系統(tǒng)：由CRISPR基因座與其串聯(lián)的Cas基因組成，通過(guò)序列特異的RNA介導(dǎo)，切割降解DNA。Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromi
6、crepeats(CRISPR)/Cas9CRISPR：成簇規(guī)律間隔性短回文重復(fù)序列Cas：CRISPR相關(guān)基因RNA干擾（RNAi)siRNA、miRNARNA干擾技術(shù)策略、應(yīng)用基因敲除基因編輯常用分子生物學(xué)技術(shù)：RNA干擾、基因敲除小結(jié)作業(yè)比較RNA干擾與基因敲除的異同點(diǎn)，簡(jiǎn)述它們?cè)谒帉W(xué)中的應(yīng)用。第十一章外源基因表達(dá)與基因工程藥物基因工程藥物重組人胰島素重組人白細(xì)胞介素-2重組人干擾素外源基因表達(dá)：利用分子生物學(xué)技術(shù)，在體外將外源基因重組至合適表達(dá)載體上，通過(guò)有關(guān)技術(shù)將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞，借助宿主
7、細(xì)胞內(nèi)系統(tǒng)，合成具有生物活性的蛋白質(zhì)?；蚬こ碳夹g(shù)：基因克隆（上游技術(shù)）+外源基因表達(dá)（下游技術(shù)）基因克隆上世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種分子生物學(xué)技術(shù)，也稱分子克隆。通過(guò)相應(yīng)技術(shù)手段，將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并在宿主細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制。按步驟可概括為∶分、切、連、轉(zhuǎn)、篩。切連轉(zhuǎn)篩獲取目的基因和載體目的基因和載體連接重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞重組體的篩選與鑒定分限制酶切割基因克隆一、目的DNA的分離獲?。ǚ郑┒⑤d體的選擇與限制酶切（切）三、目的DNA與載體連接（連）四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）五、重組體
8、的篩選與鑒定（篩）基因克隆五個(gè)基本部分（一）目的基因的獲得1、化學(xué)合成適用于合成分子量較小的目的基因2、PCR及RT-PCR合成序列已知的基因3、基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)包含全面的基因和mRNA信息適用于合成分子量較小的目的基因（100bp以內(nèi)），如：人生長(zhǎng)激素釋放因子、血管加壓素、干擾素、胸腺素及胰島素原的基因等。根據(jù)已知某種基因的核苷酸序列或某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列，可推導(dǎo)出為該多肽編碼的核苷酸短序列，再用DNA合成儀人工合成目的基因。1、化學(xué)合成DNA片段2、PCR與RT-P
