外源基因表達(dá)與基因工程藥物ppt培訓(xùn)課件

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1、第十章外源基因表達(dá)與基因工程藥物第一節(jié)概述外源基因的表達(dá)：利用細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶系及其調(diào)控系統(tǒng)，將外源基因轉(zhuǎn)錄成肽鏈或加工成活性蛋白質(zhì)的過(guò)程。具體的說(shuō)，利用分子生物學(xué)技術(shù)，在體外將編碼外源蛋白質(zhì)的基因重組至適宜的表達(dá)載體上，通過(guò)相關(guān)技術(shù)將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，借助宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后修飾酶系及相應(yīng)的調(diào)控系統(tǒng)，在宿主細(xì)胞合成或分泌具有原有生物活性的蛋白質(zhì)。目的：針對(duì)難以或無(wú)法從自然界直接提取、分離、純化所獲得的，或制造成本、產(chǎn)量規(guī)模等受限制的，或利用化學(xué)方法無(wú)法合成的多肽，蛋白質(zhì)、酶這類生物分子藥物，利用細(xì)胞或組

2、織或器官或生命體的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及其調(diào)控系統(tǒng)以及翻譯后加工、修飾等體系，按人的意愿生物合成這些生物分子，并從中將表達(dá)產(chǎn)物分離純化至預(yù)期程度，最終加工成藥品?；蚬こ谈拍罨蚬こ?geneticengineering）是指采用人工方法將不同來(lái)源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過(guò)程，從而改變生物特性或創(chuàng)造新的生物類型的技術(shù)基因工程的發(fā)展史一、基因表達(dá)基本原理基因表達(dá)(geneexpression)是指儲(chǔ)存遺傳信息的基因在各種調(diào)節(jié)機(jī)制下經(jīng)過(guò)一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個(gè)過(guò)程。典

3、型的基因表達(dá)是基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)過(guò)程?；蚬こ碳夹g(shù)的核心是基因表達(dá)技術(shù)?；蛑亟M的主要目的是要使目的基因在某一細(xì)胞中能得到高效表達(dá)。基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別原核生物與真核生物肽鏈合成過(guò)程的主要差別原核生物真核生物mRNA一條mRNA編碼幾種蛋白質(zhì)（多順?lè)醋樱┮粭lmRNA編碼一種蛋白質(zhì)（單順?lè)醋樱┺D(zhuǎn)錄后很少加工轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行首尾修飾及剪接轉(zhuǎn)錄、翻譯和mRNA的降解可同時(shí)發(fā)生mRNA在核內(nèi)合成，加工后進(jìn)入胞液，再作為模板指導(dǎo)翻譯核蛋白體30S小亞基＋50S大亞基?70S核蛋白體40

4、S小亞基＋60S大亞基?80S核蛋白體起始階段起始氨基酰-tRNA為fMet-tRNAfMet起始氨基酰-tRNA為Met-tRNAiMet核蛋白體小亞基先與mRNA結(jié)合,再與fMet-tRNAfMet結(jié)合核蛋白體小亞基先與Met-tRNAiMet結(jié)合，再與mRNA結(jié)合mRNA中的S-D序列與16SrRNA3?-端的一段序列結(jié)合mRNA中的帽子結(jié)構(gòu)與帽子結(jié)合蛋白復(fù)合物結(jié)合有3種IF參與起始復(fù)合物的形成有至少10種eIF參與起始復(fù)合物的形成延長(zhǎng)階段延長(zhǎng)因子為EF-Tu、EF-Ts和EF-G延長(zhǎng)因子為eEF-1α

5、、eEF-1βγ和eEF-2終止階段釋放因子為RF-1、RF-2和RF-3釋放因子為eRF蛋白質(zhì)合成的特點(diǎn)1.真核生物的蛋白質(zhì)合成與mRNA的轉(zhuǎn)錄分開進(jìn)行原核生物的蛋白質(zhì)合成與mRNA的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)在一起同時(shí)進(jìn)行2.真核生物中的mRNA為單順?lè)醋釉松镏械膍RNA為多順?lè)醋?.真核生物合成體系中的RNA和蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上與原核生物不同，且其線粒體有獨(dú)立的蛋白質(zhì)生物合成體系阻遏蛋白介導(dǎo)的負(fù)調(diào)控和cAMP-CAP介導(dǎo)的正調(diào)控共同擔(dān)負(fù)著原核生物體內(nèi)糖源的協(xié)調(diào)利用翻譯水平的調(diào)控是對(duì)原核生物轉(zhuǎn)錄水平的補(bǔ)充1.轉(zhuǎn)錄與翻譯的偶

6、聯(lián)提高了基因表達(dá)調(diào)控的有效性2.SD序列影響翻譯起始速率3.翻譯阻遏利用蛋白與自身mRNA的結(jié)合實(shí)現(xiàn)翻譯起始的調(diào)控4.mRNA密碼子的編碼頻率影響翻譯的延伸速度基因表達(dá)調(diào)控的影響因素——原核生物（一）真核生物染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄1.轉(zhuǎn)錄活化的染色質(zhì)對(duì)核酸酶極為敏感2.轉(zhuǎn)錄活化的染色質(zhì)的組蛋白發(fā)生改變3.RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的上游和下游具有不同的超螺旋構(gòu)象4.CpG島甲基化水平降低（二）順式作用原件（啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和沉默子）直接影響基因表達(dá)活性（三）轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控（四）真核生物在轉(zhuǎn)錄后仍可控制mRNA的結(jié)構(gòu)和

7、功能，其在轉(zhuǎn)錄后層次不同于原核生物基因表達(dá)調(diào)控的影響因素——真核生物目標(biāo)蛋白性質(zhì)是否需要糖基化三維結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)原核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)是否二、基因表達(dá)基本類型原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)，芽孢桿菌系統(tǒng)等產(chǎn)物溶解情況表達(dá)位置產(chǎn)物結(jié)構(gòu)狀態(tài)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞等包涵體可溶性胞內(nèi)定位表達(dá)分泌表達(dá)非融合表達(dá)融合表達(dá)第二節(jié)外源基因表達(dá)基本過(guò)程將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，使該基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)【四個(gè)要素】工具酶、載體、基因和受體（宿主

8、）細(xì)胞基因工程的基本過(guò)程目的基因的獲?。簭纳矬w中分離或人工合成重組載體的構(gòu)建：對(duì)目的基因和載體DNA進(jìn)行剪切、修飾，在連接酶的作用下連接形成完整有復(fù)制能力的重組體重組DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞：重組DNA分子引入受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增基因工程的基本過(guò)程重組體的篩選與鑒定：直接篩選法(如抗藥標(biāo)志選擇)和免疫學(xué)方法目的基因的表達(dá)及分離純化：原核與真核表達(dá)一、目的基因的獲得外源基因表達(dá)的第一步是獲得目的基