guan-6-外源基因在真核細(xì)胞中的表達

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1、外源基因在真核細(xì)胞中的表達ExpressionInEukaryoticHostCellsDNARNAproteinBiologicalactivityGenecopynumberPromoteractivitymRNAstabilityRibosomebindingsiteCodonusageProteinstabilityManyhost-dependentfactors人們合成與生物相關(guān)的物質(zhì)是從尿素開始的，1828年，德國化學(xué)家維勒人工合成了存在于生物體的這種有機物。在1960年我國科學(xué)家采用化學(xué)方法首次成功地合成了具有

2、生物活性的蛋白質(zhì)——胰島素。隨著內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)用各種不同的載體在原核、真核系統(tǒng)中進行蛋白表達更為行之有效。而這其中大腸桿菌表達系統(tǒng)發(fā)展得最為迅速、成熟。原核表達具有操作方便、快捷，需時較短，表達量大，適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。原核表達系統(tǒng)：大腸桿菌表達系統(tǒng)、枯草桿菌表達系統(tǒng)優(yōu)勢：高產(chǎn)量，操作簡便缺陷：較多哺乳動物蛋白基因很難在此系統(tǒng)表達產(chǎn)生有功能的蛋白原因——蛋白表達后的正確折疊和修飾真核表達系統(tǒng)：酵母表達系統(tǒng)yeastexpressionsystem-Pichiapastoris昆蟲表達系統(tǒng)Insec

3、texpressionsystem-Baculoviruses哺乳動物細(xì)胞表達系統(tǒng)Mammalianexpressionsystem外源基因在真核表達系統(tǒng)中表達的3環(huán)節(jié)：載體的構(gòu)建；構(gòu)建的載體DNA在真核細(xì)胞中的導(dǎo)入；表達產(chǎn)物的鑒定真核表達載體至少要含兩類序列：①原核質(zhì)粒的序列，包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始序列、能用在細(xì)菌中篩選克隆的抗藥性基因標(biāo)志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組DNA克隆、并復(fù)制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。②在真核宿主細(xì)胞中表達重組基因所需要的元件，包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)

4、錄終止和加poly-A信號序列、mRNA剪接信號序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細(xì)胞中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切酶識別位點等。第一節(jié)外源基因在畢赤酵母中的表達酵母是目前最常用的表達系統(tǒng)之一。優(yōu)點：成長快，易培養(yǎng)，成本低，遺傳操作方便，能進行翻譯后加工和修飾巴氏畢赤酵母（Pichiapastoris）用于基因工程表達外源蛋白的優(yōu)點：發(fā)酵密度高；外源基因表達量高；可以建立有效的分泌型表達；（分泌型表達？）減輕宿主的代謝壓力，減少受蛋白酶降解的危險，方便產(chǎn)物的純化，也利于二硫鍵的正確折疊。影響

5、外源基因在巴氏畢赤酵母中表達的因素1、外源基因特性外源基因在（巴氏畢赤酵母）Pp中表達時，其自身就是影響表達水平的重要因素。不同的培養(yǎng)基配方、發(fā)酵參數(shù)和飼養(yǎng)方案主要是通過提高細(xì)胞絕對總數(shù)而并非單個細(xì)胞產(chǎn)率來提高外源蛋白的產(chǎn)量。Fahnestock等發(fā)現(xiàn)隨著外源的蛛牽拉絲蛋白基因拷貝數(shù)的增加，其生產(chǎn)效率會相對有所降低。另外，許多高A+T含量的基因常會由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄;不合適的mRNA5’非翻譯區(qū)的核苷酸序列和長度也可能會使基因的表達不盡人意。提前終止被認(rèn)為是一種具有種屬特異性的現(xiàn)象，譬如在Pp中不能表達的HIVENV蛋

6、白在啤酒酵母中卻表達良好。因此，可以通過調(diào)整高A+T含量區(qū)的核苷酸組成來避免提前終止的發(fā)生。而Sreekrishna等通過調(diào)整人血清白蛋白(humanserumalbumin，HSA)的mRNA5’非翻譯區(qū)與醇氧化酶(alcoholoxidase1，AOX1)的5’非翻譯區(qū)相同后，HSA的表達量可以提高50倍以上。限于目前對Pp的了解程度，仍然無法預(yù)見某種外源蛋白是否能在其中獲得高產(chǎn)。2、表達框的染色體整合位點和方式雖然相對于自主復(fù)制載體來講，整合性載體的轉(zhuǎn)化率較低，但由于Pp沒有天然質(zhì)粒，所以設(shè)計表達載體偏向于染色體整合，通

7、過同源重組，載體整合到細(xì)胞染色體中間。整合性載體具有表達框穩(wěn)定和可控制整合位點等優(yōu)越性，并且能夠發(fā)生多位點整合而獲得多拷貝。3、基因劑量許多實例表明，含單拷貝表達框的宿主菌足以得到最佳產(chǎn)量，而在大多數(shù)情況下，隨著拷貝數(shù)的增加表達產(chǎn)物量也會相應(yīng)增加。Jeffrey等發(fā)現(xiàn)，重組CD40L的最高產(chǎn)量是在含有8個以上表達框的菌株中獲得的。Clare等的實驗結(jié)果也表明，重組鼠表皮生長因子(mECF)在Pp中的表達量與其基因量成正相關(guān)，而高拷貝、高表達量的宿主菌株可以通過一種快速DNA斑點雜交的篩選方式獲得。不過個別情況下拷貝數(shù)增加對產(chǎn)量

8、也會產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，似乎表明分泌效率低的蛋白在過高表達的情況下會對分泌途徑形成負(fù)反饋抑制。因此，基因拷貝數(shù)對表達量的影響是無法預(yù)測的。高表達菌株的篩選只應(yīng)以表達的蛋白量為唯一標(biāo)準(zhǔn)Jeffrey等建立了一種雙濾膜篩查方法，首先將菌落轉(zhuǎn)在醋酸纖維素膜上，再與硝酸纖維素膜疊放在酵母固體