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1、外源基因在宿主細胞中的高效表達-I影響外源基因表達的因素有效的轉錄起始?主要的限速步驟?選擇強的可調控的啟動子及相關的調控序列，是組建一個高效表達載體的首要問題啟動子:位于結構基因5’端上游區(qū)的DNA序列,活化RNA聚合酶啟動子的特征:序列特異性、方向性、位置特性、種屬特異性舉例說明原核生物的啟動子和真核生物的啟動子。啟動子根據(jù)作用方式及功能分類：?組成型啟動子(constitutivepromoter)：在個體的任何細胞中均有表達活性的啟動子?誘導型啟動子?組織特異型啟動子最理想的強的可調控的啟動子應該是：在發(fā)酵的早期階段表達載體的
2、啟動子被緊緊地阻遏，這樣可以避免出現(xiàn)表達載體不穩(wěn)定，細胞生長緩慢或者由于產(chǎn)物表達而引起細胞死亡等問題。當細胞達到一定的密度，通過多種誘導使阻遏物失活，RNA聚合酶快速啟動轉錄。原核細胞的啟動子：lac,trp,tac,phoA,lPL,lPＲ都是這一類啟動子（誘導型啟動子，induciblepromoters)）。T7噬菌體啟動子則是另一種類型的啟動子，即組成型啟動子（constitutivepromoters）。Ｔ７噬菌體啟動子只為Ｔ７噬菌體的ＲＮＡ聚合酶所識別，而被Ｔ７RNA聚合酶所起始的轉錄非?；钴S，使得由宿主細胞的RNA聚合酶
3、所進行的轉錄根本無法與之競爭，這樣使細胞中幾乎所有的轉錄都是由Ｔ７RNA聚合酶所操縱，在1-3小時內，目標基因的RNA轉錄水平可以達到rRNA水平。由于Ｔ７RNA聚合酶幾乎能完整地轉錄在Ｔ７啟動子控制下的所有DNA序列，所以近年來許多實驗室開始選用Ｔ７噬菌體啟動子進行外源基因的高效表達。Ｔ７啟動子調控下的表達載體已經(jīng)形成一個系列，根據(jù)外源基因的插入位點可以分別獲得直接表達和融合表達。舉例：?pET,pRSET?真核基因的表達調控要比原核復雜得多，然而啟動子和增強子作為兩個重要的轉錄調控序列，為外源基因在真核細胞中高效表達所必需?真核啟
4、動子也分為：組成型和誘導型兩大類?組成型啟動子如：SV40、腺病毒、人巨細胞病毒（CMV）、Rous肉瘤病毒?誘導型啟動子如：干擾素β啟動子、熱休克啟動子、激素誘導的啟動子mRNA的有效延伸和轉錄終止與基因的高效表達?外源基因的轉錄一旦被起始，接下來的問題就是如何保證mRNA有效的延伸、終止和穩(wěn)定的積累，尤其在真核細胞中?在轉錄物內的衰減（attenuation)和非特異性終止可以誘發(fā)轉錄中的mRNA分子的提前終止（prematuretermination）?衰減子（attenuators）具有簡單終止子的特性，在原核細胞中處于生物合
5、成的操縱子的啟動子和第一個結構基因之間?由于衰減子序列是負調控元件，為了保證mRNA轉錄完全，在表達載體的構建中要盡量避免其存在?色氨酸操縱子中的衰減子（attenuator）?正常的轉錄終止子的存在也是外源基因高效表達的一個因素，其作用是防止不必要的轉錄，使mRNA的長度限制到最小，增加表達質粒的穩(wěn)定性?為了防止mRNA在轉錄中的非特異性終止，抗終止序列元件（antiterminationelements）可以加入到表達載體上?對于真核細胞而言，表達載體上含有轉錄終止序列和polyA加入位點，是外源基因高水平表達的重要因素mRNA的
6、穩(wěn)定性與基因的高效表達?mRNA的穩(wěn)定性直接關系到翻譯產(chǎn)物的多少，提高其穩(wěn)定性能提高基因表達效率?相關報道很少?對于原核細胞，利用RNase缺失的受體菌是一個可供選擇的方案?對于真核細胞，可以按照基因表達調控中的原則，使mRNA5’端和3’端正確加工，提高成熟mRNA的穩(wěn)定性?有效的翻譯起始與基因的高效表達?翻譯是mRNA指導的多肽鏈合成的過程?翻譯起始是多種成分協(xié)同作用的過程，其中包括：mRNA、16SrRNA、fMet-tRNA之間的堿基配對，同時，還有核糖體S1蛋白和蛋白合成起始因子的相互作用?在原核細胞中，影響翻譯起始的因素有
7、：起始密碼子、核糖體結合位點（SD）、起始密碼與SD序列之間的距離、核苷酸組成、mRNA的二級結構以及mRNA上游的5’端非翻譯序列和蛋白編碼區(qū)的5’端序列等。SD序列也即核糖體結合位點（RBS）的序列（是指原核細胞mRNA5’端非翻譯區(qū)同16SrRNA3’端的互補序列）作為翻譯起始，可以達到最大效率的一般原則是：（1）AUG（ATG）是首選的起始密碼子（GUG、UUG、AUU、AUA有時也可用，但非最佳選擇）（2）SD序列也即核糖體結合位點（RBS）的序列（是指原核細胞mRNA5’端非翻譯區(qū)同16SrRNA3’端的互補序列）按照統(tǒng)計
8、學的原則，一般的SD序列至少含AGGAGG序列中的4個堿基。SD序列的存在對原核細胞mRNA的轉譯起始非常重要（3）SD與起始密碼之間的距離以9±3為適宜。也有報道指出如果SD序列同16SrRNA3’端的互補堿基大于8時
