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《外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)1.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、外源基因在宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)-I影響外源基因表達(dá)的因素有效的轉(zhuǎn)錄起始?主要的限速步驟?選擇強(qiáng)的可調(diào)控的啟動子及相關(guān)的調(diào)控序列，是組建一個高效表達(dá)載體的首要問題啟動子:位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的DNA序列,活化RNA聚合酶啟動子的特征:序列特異性、方向性、位置特性、種屬特異性舉例說明原核生物的啟動子和真核生物的啟動子。啟動子根據(jù)作用方式及功能分類：?組成型啟動子(constitutivepromoter)：在個體的任何細(xì)胞中均有表達(dá)活性的啟動子?誘導(dǎo)型啟動子?組織特異型啟動子最理想的強(qiáng)的可調(diào)控的啟動子應(yīng)該是：在發(fā)酵的早期階段表達(dá)載體的
2、啟動子被緊緊地阻遏，這樣可以避免出現(xiàn)表達(dá)載體不穩(wěn)定，細(xì)胞生長緩慢或者由于產(chǎn)物表達(dá)而引起細(xì)胞死亡等問題。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定的密度，通過多種誘導(dǎo)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速啟動轉(zhuǎn)錄。原核細(xì)胞的啟動子：lac,trp,tac,phoA,lPL,lPＲ都是這一類啟動子（誘導(dǎo)型啟動子，induciblepromoters)）。T7噬菌體啟動子則是另一種類型的啟動子，即組成型啟動子（constitutivepromoters）。Ｔ７噬菌體啟動子只為Ｔ７噬菌體的ＲＮＡ聚合酶所識別，而被Ｔ７RNA聚合酶所起始的轉(zhuǎn)錄非?；钴S，使得由宿主細(xì)胞的RNA聚合酶
3、所進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄根本無法與之競爭，這樣使細(xì)胞中幾乎所有的轉(zhuǎn)錄都是由Ｔ７RNA聚合酶所操縱，在1-3小時內(nèi)，目標(biāo)基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平可以達(dá)到rRNA水平。由于Ｔ７RNA聚合酶幾乎能完整地轉(zhuǎn)錄在Ｔ７啟動子控制下的所有DNA序列，所以近年來許多實驗室開始選用Ｔ７噬菌體啟動子進(jìn)行外源基因的高效表達(dá)。Ｔ７啟動子調(diào)控下的表達(dá)載體已經(jīng)形成一個系列，根據(jù)外源基因的插入位點可以分別獲得直接表達(dá)和融合表達(dá)。舉例：?pET,pRSET?真核基因的表達(dá)調(diào)控要比原核復(fù)雜得多，然而啟動子和增強(qiáng)子作為兩個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，為外源基因在真核細(xì)胞中高效表達(dá)所必需?真核啟
4、動子也分為：組成型和誘導(dǎo)型兩大類?組成型啟動子如：SV40、腺病毒、人巨細(xì)胞病毒（CMV）、Rous肉瘤病毒?誘導(dǎo)型啟動子如：干擾素β啟動子、熱休克啟動子、激素誘導(dǎo)的啟動子mRNA的有效延伸和轉(zhuǎn)錄終止與基因的高效表達(dá)?外源基因的轉(zhuǎn)錄一旦被起始，接下來的問題就是如何保證mRNA有效的延伸、終止和穩(wěn)定的積累，尤其在真核細(xì)胞中?在轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減（attenuation)和非特異性終止可以誘發(fā)轉(zhuǎn)錄中的mRNA分子的提前終止（prematuretermination）?衰減子（attenuators）具有簡單終止子的特性，在原核細(xì)胞中處于生物合
5、成的操縱子的啟動子和第一個結(jié)構(gòu)基因之間?由于衰減子序列是負(fù)調(diào)控元件，為了保證mRNA轉(zhuǎn)錄完全，在表達(dá)載體的構(gòu)建中要盡量避免其存在?色氨酸操縱子中的衰減子（attenuator）?正常的轉(zhuǎn)錄終止子的存在也是外源基因高效表達(dá)的一個因素，其作用是防止不必要的轉(zhuǎn)錄，使mRNA的長度限制到最小，增加表達(dá)質(zhì)粒的穩(wěn)定性?為了防止mRNA在轉(zhuǎn)錄中的非特異性終止，抗終止序列元件（antiterminationelements）可以加入到表達(dá)載體上?對于真核細(xì)胞而言，表達(dá)載體上含有轉(zhuǎn)錄終止序列和polyA加入位點，是外源基因高水平表達(dá)的重要因素mRNA的
6、穩(wěn)定性與基因的高效表達(dá)?mRNA的穩(wěn)定性直接關(guān)系到翻譯產(chǎn)物的多少，提高其穩(wěn)定性能提高基因表達(dá)效率?相關(guān)報道很少?對于原核細(xì)胞，利用RNase缺失的受體菌是一個可供選擇的方案?對于真核細(xì)胞，可以按照基因表達(dá)調(diào)控中的原則，使mRNA5’端和3’端正確加工，提高成熟mRNA的穩(wěn)定性?有效的翻譯起始與基因的高效表達(dá)?翻譯是mRNA指導(dǎo)的多肽鏈合成的過程?翻譯起始是多種成分協(xié)同作用的過程，其中包括：mRNA、16SrRNA、fMet-tRNA之間的堿基配對，同時，還有核糖體S1蛋白和蛋白合成起始因子的相互作用?在原核細(xì)胞中，影響翻譯起始的因素有
7、：起始密碼子、核糖體結(jié)合位點（SD）、起始密碼與SD序列之間的距離、核苷酸組成、mRNA的二級結(jié)構(gòu)以及mRNA上游的5’端非翻譯序列和蛋白編碼區(qū)的5’端序列等。SD序列也即核糖體結(jié)合位點（RBS）的序列（是指原核細(xì)胞mRNA5’端非翻譯區(qū)同16SrRNA3’端的互補(bǔ)序列）作為翻譯起始，可以達(dá)到最大效率的一般原則是：（1）AUG（ATG）是首選的起始密碼子（GUG、UUG、AUU、AUA有時也可用，但非最佳選擇）（2）SD序列也即核糖體結(jié)合位點（RBS）的序列（是指原核細(xì)胞mRNA5’端非翻譯區(qū)同16SrRNA3’端的互補(bǔ)序列）按照統(tǒng)計
8、學(xué)的原則，一般的SD序列至少含AGGAGG序列中的4個堿基。SD序列的存在對原核細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)譯起始非常重要（3）SD與起始密碼之間的距離以9±3為適宜。也有報道指出如果SD序列同16SrRNA3’端的互補(bǔ)堿基大于8時
