包涵體即表達(dá)外源基因的宿主細(xì)胞

《包涵體即表達(dá)外源基因的宿主細(xì)胞》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、包涵體即表達(dá)外源基因的宿主細(xì)胞，可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌；也可以是真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。包涵體是病毒在增殖的過程中，常使寄主細(xì)胞內(nèi)形成一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)，在光學(xué)顯微鏡下可見。多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆?；蛏形囱b配的病毒亞基聚集而成；少數(shù)則是宿主細(xì)胞對病毒感染的反應(yīng)產(chǎn)物，不含病毒粒子。簡介　　包涵體（inclusionbody）　　基因工程定義：在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子??包涵體，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。　　病毒在增殖的過程中

2、，常使寄主細(xì)胞內(nèi)形成一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)，在光學(xué)顯微鏡下可見。多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆?；蛏形囱b配的病毒亞基聚集而成；少數(shù)則是宿主細(xì)胞對病毒感染的反應(yīng)產(chǎn)物，不含病毒粒子。有的位于細(xì)胞質(zhì)中（如天花病毒包涵體），有的位于細(xì)胞核中（如皰疹病毒），或細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中都有（如麻疹病毒）。有的還具有特殊名稱，如天花病毒包涵體叫顧氏（Guarnieri）小體，狂犬病毒包涵體叫內(nèi)基氏（Negri）小體。昆蟲病毒可根據(jù)包涵體的形狀、位置而分為細(xì)胞質(zhì)型多角體病毒、核型多角及顆粒體病毒等。編輯本段組成與特性　　一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、??包涵體RNA聚合酶、外膜蛋白

3、ompC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。編輯本段形成　　主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的?！　?、表達(dá)量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白??沙眼衣原體包涵體間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。　　2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)

4、?！　?、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。　　4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達(dá)分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例?！　≡诨蛑亟M技術(shù)得到迅速發(fā)展之前，研究者就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)人工引入反常的蛋白質(zhì)（這些蛋白質(zhì)可以看作是細(xì)胞的外源蛋白質(zhì)），這些蛋白質(zhì)會(huì)堆積起來形成不溶的形式。這些蛋白質(zhì)聚集的形態(tài)是明顯的球形，這些球形的物質(zhì)全部是蛋白質(zhì)，并且通過非共價(jià)鍵的作用力形成，必須使用變性劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）或者鹽酸胍才能溶解。自從基因工程的蛋白質(zhì)在大腸桿菌表達(dá)以

5、后，人們逐漸發(fā)現(xiàn)這些外源蛋白質(zhì)基因在細(xì)胞中的過量表達(dá)同樣形成不溶性的狀態(tài)。　　Georgiou等人發(fā)現(xiàn)天然的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中大量表達(dá)時(shí)，如內(nèi)酰氨酶和堿性磷酸酶的過量表達(dá)，都形成了包涵體，前者的包涵體在外周質(zhì)，后者的包涵體存在于細(xì)胞質(zhì)中。其它的宿主細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了重組蛋白質(zhì)過量表達(dá)時(shí)形成的包涵體或者聚集體，如細(xì)菌病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中?！　“w在一些外界壓力下也可以形成，如溫度，是影響包涵體形成與否的主要因素。有些蛋白質(zhì)在高溫的情況下容易形成包涵體，這是由于這些蛋白質(zhì)在高溫下容易變性而形成聚集體。所以有人認(rèn)為，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)具有高的融化溫度、高的天然構(gòu)象穩(wěn)定性的情況下，包涵體就不容易形成。但是，對一些

6、體內(nèi)包涵體形成的研究發(fā)現(xiàn)，包涵體的形成先于成熟肽鏈的形成，或者是同時(shí)進(jìn)行的。在研究P22尾刺蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)，盡管尾刺蛋白質(zhì)有高的穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)中主要是片斷，融化的溫度是88℃，并不受SDS、蛋白質(zhì)酶和熱失活的作用，但是這種蛋白質(zhì)是為數(shù)不多的在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體的原核蛋白質(zhì)模型。有些天然的蛋白質(zhì)在高溫（391℃??包涵體熒光圖）表達(dá)時(shí)可以提高25%，但是這些蛋白質(zhì)不能折疊成天然的狀態(tài)而形成聚集體。聚集體形成的動(dòng)力學(xué)表明，這些聚集體是從部分折疊的中間體形成的。實(shí)際上，這些折疊的中間體或者形成天然的狀態(tài)，或者形成聚集體，這個(gè)過程是溫度依賴性的，溫度的升高利于聚集體的形成。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)肽鏈在高溫下表達(dá)，合成的肽鏈

7、足夠早地轉(zhuǎn)移到低溫下時(shí)，這些蛋白質(zhì)肽鏈會(huì)重新進(jìn)入折疊的過程。同時(shí)，當(dāng)尾刺蛋白質(zhì)在允許的溫度下表達(dá)后，再把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到高溫下，這些蛋白質(zhì)肽鏈保持活性，證明了一旦蛋白質(zhì)被正確的表達(dá)并折疊成正確的構(gòu)象以后，則細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解性在高溫下不再改變。蛋白質(zhì)在體內(nèi)折疊的中間體對于溫度因子明顯敏感。　　沙眼衣原體包涵體最近認(rèn)為較高的溫度可能增加了蛋白質(zhì)合成的速度、折疊中間體形成聚集體的速度以及疏水相互作