外源基因在宿主細(xì)胞中的

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1、Chapter9:High-levelexpressionofforeigngenes§1.genesilence§2.expressionsystemsofforeigngene§3.Isolatingandpurifyingtheproductofforeigngenes§1.genesilence(基因沉默)GeneSilencing?外源基因存在于生物體內(nèi)，并未丟失或損傷，但該基因不表達(dá)或表達(dá)量極低的現(xiàn)象。.Genesilencingcanoccurateithertranscriptionallevel(TGS,TranscriptionalGeneSil

2、encing),orpost-transcriptionallevel(PTGS,Post-TranscriptionalGeneSilencing).TGS:MethylationInducedRepeat-InducedGeneSilencing(RIGC),positioneffect,andsoonPTGS:cosuppression,andsoonMethylationInducedHistone:組蛋白deacetylase去乙?；富虮磉_(dá)系統(tǒng)原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)、藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。真核生物基因表達(dá)系

3、統(tǒng)：如酵母表達(dá)系統(tǒng)、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等?！?.expressionsystemsofforeigngene一、外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)欲將外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)，必須滿足以下條件：①通過表達(dá)載體將外源基因?qū)怂拗骶⒗盟拗骶拿赶到y(tǒng)合成外源蛋白；②外源基因不能帶有間隔順序(內(nèi)含子)，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA；③必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和S-D序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)；④外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架(openreadingframe，ORF)；⑤利用宿主菌

4、的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對宿主菌的毒害。（一）基因表達(dá)的調(diào)控序列對原核生物來講，基因表達(dá)的調(diào)控序列主要涉及啟動(dòng)子、S-D序列、終止子、衰減子等序列。1.啟動(dòng)子是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致順序（consensussequence）。-35Box和-10BoxTTGACATATAATTranscriptionalstartsite5’3’-35-1016-19bp5-9bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45原核細(xì)胞RNA聚合酶不能識(shí)別真核

5、基因的啟動(dòng)子。為了表達(dá)真核基因，必須將其克隆在原核啟動(dòng)子的下游，才在原核表達(dá)系統(tǒng)中被轉(zhuǎn)錄。最佳啟動(dòng)子必須具備的條件①必須是一種強(qiáng)啟動(dòng)子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上。②應(yīng)呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄便于表達(dá)毒性蛋白等。③應(yīng)是可誘導(dǎo)型的用溫度或化學(xué)試劑誘導(dǎo)。（2）-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離間隔為17bp時(shí)，啟動(dòng)子最強(qiáng)。（3）-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序越接近一致順序，啟動(dòng)子越強(qiáng)。5’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’①-35box②-10box（PribnowBox）Ptac=3Ptrp=11Plac啟動(dòng)子-35區(qū)序列-10區(qū)序列Plac

6、TTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtraATAGACATAATGTPlLTTGACAGATACTPrecATTGATATATAAT啟動(dòng)子tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)在原核生物表達(dá)系統(tǒng)中，通常使用的可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子有l(wèi)ac(乳糖啟動(dòng)子)、trp(色氨酸啟動(dòng)子)、PL和PR(λ噬菌體的左向和右向啟動(dòng)子)以及tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)等。2．S-D序列mRNA在細(xì)菌中的轉(zhuǎn)譯效率依賴于是否有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的存在，即S-D序列以及S-D序列與起始密碼子AUG之間的距離。S-D序列(AGGAGG)后面的4個(gè)堿

7、基：如果是A（T）,翻譯效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離為3～9個(gè)堿基。多數(shù)情況下為7bp，此間的堿基多一個(gè)或少一個(gè)都會(huì)影響翻譯的起始效率。AUG左側(cè)的三個(gè)堿基也有影響。?-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左側(cè)如果是UAU或CUU時(shí)，最為有效；如果是UUC、UCA或AGG時(shí)下降20倍。3．終止子在一個(gè)基因的3’端或是一個(gè)操縱子的3，端往往還有一特定的核苷酸序列，它有終止轉(zhuǎn)錄的功能，這一DNA序列稱為轉(zhuǎn)錄終止子(terminator)。共同的特點(diǎn)，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G／C的區(qū)域，G／C富含區(qū)域又具有