guan6外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)

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1、外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)ExpressionInEukaryoticHostCellsDNARNAproteinBiologicalactivityGenecopynumberPromoteractivitymRNAstabilityRibosomebindingsiteCodonusageProteinstabilityManyhost-dependentfactors人們合成與生物相關(guān)的物質(zhì)是從尿素開始的，1828年，德國化學(xué)家維勒人工合成了存在于生物體的這種有機物。在1960年我國科學(xué)家采用

2、化學(xué)方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白質(zhì)——胰島素。隨著內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)用各種不同的載體在原核、真核系統(tǒng)中進行蛋白表達(dá)更為行之有效。而這其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展得最為迅速、成熟。原核表達(dá)具有操作方便、快捷，需時較短，表達(dá)量大，適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。原核表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢：高產(chǎn)量，操作簡便缺陷：較多哺乳動物蛋白基因很難在此系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)生有功能的蛋白原因——蛋白表達(dá)后的正確折疊和修飾真核表達(dá)系統(tǒng)：酵母表達(dá)系統(tǒng)yeastexpressionsyst

3、em-Pichiapastoris昆蟲表達(dá)系統(tǒng)Insectexpressionsystem-Baculoviruses哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)Mammalianexpressionsystem外源基因在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的3環(huán)節(jié)：載體的構(gòu)建；構(gòu)建的載體DNA在真核細(xì)胞中的導(dǎo)入；表達(dá)產(chǎn)物的鑒定真核表達(dá)載體至少要含兩類序列：①原核質(zhì)粒的序列，包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始序列、能用在細(xì)菌中篩選克隆的抗藥性基因標(biāo)志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組DNA克隆、并復(fù)制繁殖得

4、到足夠使用的數(shù)量。②在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件，包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止和加poly-A信號序列、mRNA剪接信號序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細(xì)胞中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切酶識別位點等。第一節(jié)外源基因在畢赤酵母中的表達(dá)酵母是目前最常用的表達(dá)系統(tǒng)之一。優(yōu)點：成長快，易培養(yǎng)，成本低，遺傳操作方便，能進行翻譯后加工和修飾巴氏畢赤酵母（Pichiapastoris）用于基因工程表達(dá)外源蛋白的優(yōu)點：發(fā)酵密度高；外源基因表達(dá)量高；可以建立有效的分泌

5、型表達(dá)；（分泌型表達(dá)？）減輕宿主的代謝壓力，減少受蛋白酶降解的危險，方便產(chǎn)物的純化，也利于二硫鍵的正確折疊。影響外源基因在巴氏畢赤酵母中表達(dá)的因素1、外源基因特性外源基因在（巴氏畢赤酵母）Pp中表達(dá)時，其自身就是影響表達(dá)水平的重要因素。不同的培養(yǎng)基配方、發(fā)酵參數(shù)和飼養(yǎng)方案主要是通過提高細(xì)胞絕對總數(shù)而并非單個細(xì)胞產(chǎn)率來提高外源蛋白的產(chǎn)量。Fahnestock等發(fā)現(xiàn)隨著外源的蛛牽拉絲蛋白基因拷貝數(shù)的增加，其生產(chǎn)效率會相對有所降低。另外，許多高A+T含量的基因常會由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄;不合適的mRN

6、A5’非翻譯區(qū)的核苷酸序列和長度也可能會使基因的表達(dá)不盡人意。提前終止被認(rèn)為是一種具有種屬特異性的現(xiàn)象，譬如在Pp中不能表達(dá)的HIVENV蛋白在啤酒酵母中卻表達(dá)良好。因此，可以通過調(diào)整高A+T含量區(qū)的核苷酸組成來避免提前終止的發(fā)生。而Sreekrishna等通過調(diào)整人血清白蛋白(humanserumalbumin，HSA)的mRNA5’非翻譯區(qū)與醇氧化酶(alcoholoxidase1，AOX1)的5’非翻譯區(qū)相同后，HSA的表達(dá)量可以提高50倍以上。限于目前對Pp的了解程度，仍然無法預(yù)見某種外源蛋

7、白是否能在其中獲得高產(chǎn)。2、表達(dá)框的染色體整合位點和方式雖然相對于自主復(fù)制載體來講，整合性載體的轉(zhuǎn)化率較低，但由于Pp沒有天然質(zhì)粒，所以設(shè)計表達(dá)載體偏向于染色體整合，通過同源重組，載體整合到細(xì)胞染色體中間。整合性載體具有表達(dá)框穩(wěn)定和可控制整合位點等優(yōu)越性，并且能夠發(fā)生多位點整合而獲得多拷貝。3、基因劑量許多實例表明，含單拷貝表達(dá)框的宿主菌足以得到最佳產(chǎn)量，而在大多數(shù)情況下，隨著拷貝數(shù)的增加表達(dá)產(chǎn)物量也會相應(yīng)增加。Jeffrey等發(fā)現(xiàn)，重組CD40L的最高產(chǎn)量是在含有8個以上表達(dá)框的菌株中獲得的。Cl

8、are等的實驗結(jié)果也表明，重組鼠表皮生長因子(mECF)在Pp中的表達(dá)量與其基因量成正相關(guān)，而高拷貝、高表達(dá)量的宿主菌株可以通過一種快速DNA斑點雜交的篩選方式獲得。不過個別情況下拷貝數(shù)增加對產(chǎn)量也會產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，似乎表明分泌效率低的蛋白在過高表達(dá)的情況下會對分泌途徑形成負(fù)反饋抑制。因此，基因拷貝數(shù)對表達(dá)量的影響是無法預(yù)測的。高表達(dá)菌株的篩選只應(yīng)以表達(dá)的蛋白量為唯一標(biāo)準(zhǔn)Jeffrey等建立了一種雙濾膜篩查方法，首先將菌落轉(zhuǎn)在醋酸纖維素膜上，再與硝酸纖維素膜疊放在酵母固體